虹鳟鱼传染性造血器官坏死症病毒的分离和鉴定

李宝玉，吴鹏程，范玉峰（.兰州威特森生物科技有限公司，甘肃　兰州　73000；.兰州市渔业技术推广中心，甘肃　兰州　73000）



虹鳟鱼传染性造血器官坏死症病毒的分离和鉴定

李宝玉1，吴鹏程2，范玉峰2
（1.兰州威特森生物科技有限公司，甘肃兰州730010；2.兰州市渔业技术推广中心，甘肃兰州730020）

摘要：本试验从甘肃永登爆发疫情的虹鳟鱼养殖场共采集了四次病料，分离出1株优势毒株，对新分离的毒株进行培养增殖，在EPC细胞上增殖良好，且可引起良好的病变；根据IHNV的保守基因N基因序列，设计特异性引物，结果扩增出786 bp的片段。对该片段进行测序分析，发现与IHNV的参考序列有较高的相似性，证实该毒株为传染性造血器官坏死症病毒。结果表明传染性造血器官坏死病毒（IHNV）在永登虹鳟鱼中的存在与传播，本研究为我国北方地区IHN疫情动态监测和防控提供依据。

关键词：IHNV；虹鳟鱼；分离；鉴定

传染性造血器官坏死症（Infectious Hematopoietic Necrosis IHN）是弹状病毒科的虹鳟传染性造血器官坏死症病毒（Infectious Hematopoietic Necrosis virus IHNV）引起的分布广泛、死亡率高、危害极大的鲑科鱼类病毒性传染病。该病1985年开始在我国东北地区各养蹲场陆续发现，目前有蔓延和加剧的趋势，对养鳟业造成了毁灭性打击［1、2］。近几年，我国每年从国外引进大批的鲑鱼鱼卵，但因检疫技术的不完善，致使危害严重、传播力强、防治困难的传染性造血器官坏死症传入我国并蔓延开来，使正在发展中的我国虹鳟养殖业留下了无穷祸患和潜在危机。

近年来省内的虹鳟鱼养殖场大多从外省购进发眼鱼卵自行孵化鱼苗，当上浮稚鱼摄食一月左右时大面积爆发疫情，表现为病稚鱼体发黑，游动迟缓，随水漂流，有时出现痉孪动作，有时一边翻滚、一边漂流，或静卧池底或狂游沉入池底而死亡，腹部膨大，有淤血斑，肌肉“V”字型或线型出血，尾柄充血，腹鳍基部和肛门周围充血，有的在肛门拖着长而不透明的白色粪便，死亡率达90%以上，对虹鳟鱼的养殖造成毁灭性打击，我省境内的大多数虹鳟鱼养殖场处于停产状态。为保障我市、我省乃至我国的养鳟业得到快速、健康的发展，对IHN疫情进行监测具有很重要的现实意义。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1主要材料及试剂患病鱼是2013年8月采自甘肃永登虹鳟鱼养殖场（体重约为20 g）；M199培养基为美国Gibco公司产品；胎牛血清购自杭州四季青生物工程公司；RNA提取试剂盒、PCR试剂盒均购自大连TaKaRa有限公司；pMD18-T载体、感受态细胞DH5α、DL-2000、质粒提取试剂盒等均为TaKaRa公司产品；鲤鱼上皮瘤细胞（EPC）购自中国动物检疫研究所；其余试剂均为分析纯产品。

1.1.2引物根据已发布IHNV的保守基因N基因序列设计特异性引物，序列为：

利用该特异性引物预期扩增出大小为786 bp的片段，引物终浓度均为20μmol/L。

1.2实验方法

1.2.1传染性造血器官坏死症病毒的分离

1.2.1.1组织病料的处理用组织研磨机将采集的病料组织样品（包括脑、肝、胰腺、脾和肾）匀浆，然后用含有双抗的M199细胞培养液按1：10的稀释度制备成组织悬浮液，于4℃过夜孵育。7 000 r/min离心15 min，收集上清液。

1.2.1.2病毒在敏感细胞上的增殖将上清液用0.45μ的滤膜过滤除菌，然后接种生长状态良好的EPC单层细胞，20℃吸附1 h后，加入含2%胎牛血清的细胞维持液，置于20℃低温培养箱中培养，待细胞感染病毒后出现细胞病变（CPE）后收集细胞培养物备用。

1.2.2传染性造血器官坏死症病毒的RT-PCR鉴定

1.2.2.1IHNV基因组RNA的提取和cDNA模板的合成用RNA提取试剂盒从有明显病变的细胞培养物中提取IHNV基因组作为模板，在PCR管中加入20μL模板溶液和2μL引物IHNS，加8μL DEPC水至总体积为30μL，置于70℃水浴反应5 min后立即冰浴然后反应管中继续加入：10μL 5倍逆转录酶浓缩缓冲液、5μL dNTP、1μL RNA酶抑制剂（20U）、2μL逆转录酶AMV（10IU），最后加DEPC水定容至50μL，混匀后42℃反应60 min，合成模板cDNA。

1.2.2.2N基因的扩增用1.2.2.1合成的cDNA作为模板，加入模板和上、下游引物进行N基因的扩增，反应体系为50μL，反应条件：94℃4 min后，变性94℃1 min，55℃退火1 min，72℃延伸 1 min；，30次循环，最后72℃引伸10 min。

1.2.1.3扩增片段序列分析将PCR产物进行序列测定、分析，与GENBANK中已登录的IHNV序列进行比较分析。

2　结果与分析

2.1IHNV在EPC细胞上的增殖

将采集的病料组织经研磨、浸毒和过滤等处理后接种生长两天的EPC细胞，在14℃条件下盲传，传至第三代五天就可出现典型的病变。（见图1、见图2）

图1　正常的EPC细胞接种

图2　IHNV五天后的EPC病变细胞

2.2从EPC细胞传至第五代出现明显病变后收集的细胞毒中提取总RNA，用设计的一对特异性引物经RT-PCR扩增出大小786 bp的片段，结果与预期相符。（见图3）

2.3将PCR扩增的IHNV核蛋白基因产物纯化回收，克隆于pMD18-T载体中，然后转化感受态细胞DH5α，将提取的阳性质粒测序，序列分析结果显示目的片段为IHNV部分核蛋白基因，与发布于NCBI上编号为J04321和IHU50402的核蛋白基因序列的相似性为98.6%和97.2%。

图3　M为DL-2000 Marker 1、2、3为PCR扩增产物用于鉴定IHNV的部分核蛋白基因RT-PCR产物的电泳图

3　讨论

我国是渔业生产大国，水生动物贸易在我国进出口贸易中占有重要的地位。但是近年来，从国内到国外，水生动物养殖病害普遍加重，严重威胁着渔业经济的健康发展。甘肃冷水资源丰富，是我国虹鳟鱼养殖大省［3、4］，但由于近年来IHN持续爆发和流行，对养鳟也造成了毁灭性打击，绝大多数虹鳟鱼养殖场处于停产状态。目前为止我国对IHN的研究还比较少，尚未有该病毒检测方法的行业标准和国家标准，国内外也没有防控该病的疫苗上市，现有的DNA疫苗处于研发阶段［5］。

国外对感染IHNV的病鱼采取的措施是全部消毁，养殖场地和设备进行全面消毒。在我国，对于养殖者来说，只考虑当前的经济损失，不考虑长远利益，仅仅是想办法推迟和减轻病鱼的死亡，致使IHN传播范围愈来愈广泛。加上IHNV非常稳定，对外界环境有较强的抵抗力，IHN流行停止后幸存鱼群处于带毒状态，这些病毒携带者通过排泄物散毒，其卵和精液也带有IHNV，使养殖环境持续处于污染状态。因此，对IHN的流行病学调查、快速检测及防治愈发显得重要。

参考文献：

［1］牛鲁琪，赵志壮.东北地区虹鳟IHN和IPN流行病学的初步研究［J］.水产学报，1988，（12）：327-331.

［2］赵志壮，牛鲁琪.中国本溪虹鳟鱼传染性造血器官坏死症（IHN）的初步研究［J］.鲑鳟渔业，1991（4）：5-6.

［3］罗浩亮.甘肃金鳟养殖技术研究［J］.水产养殖，2007（11）：8-9.

［4］刘阳河.甘肃省鲑鳟鱼养殖现状与发展途径［J］.甘肃农业科技，2004（10）：51-52.

［5］Kurath G，Garver KA.Protective immunity and lack of histopathological damage two years after DNA vaccination against infectious hematopoietic necrosis virus in trout［J］.Vaccine，2006，24（3）：345-54.

中图分类号：S965.122

文献标识码：

文章编号：1006-799X（2015）02-0035-02

作者简介：李宝玉（1973-），男，甘肃岷县人，助理研究员，主要从事预防兽医学。