线虫脂肪沉积中组织蛋白酶B的表达及功能研究

赵丽娟,鲍　斌

(合肥工业大学 生物与食品工程学院,安徽 合肥　230009)



线虫脂肪沉积中组织蛋白酶B的表达及功能研究

赵丽娟,鲍斌

(合肥工业大学 生物与食品工程学院,安徽 合肥230009)

摘要:文章利用高糖/高胆固醇饮食诱导了线虫,油红O染色结果表明线虫脂肪沉积显著增加。为了研究组织蛋白酶B在诱导线虫过程中的作用,利用实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)研究了组织蛋白酶B同源基因的表达。选取其中的关键基因利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,研究其在线虫脂肪沉积中的作用。结果表明:在线虫脂肪沉积改变后,组织蛋白酶B同源基因表达随之改变;而利用RNA干扰组织蛋白酶B关键基因cpr-3的表达,线虫的脂肪沉积未受影响。因此,组织蛋白酶B同源基因可能参与线虫脂肪沉积改变后的生理变化,而未直接参与线虫脂肪沉积的调控。

关键词:组织蛋白酶B;线虫;脂肪沉积;基因表达

全球肥胖人群的比例正在迅速扩大,作为代谢疾病,肥胖与多种疾病相关,其中包括脂肪肝、心血管疾病、动脉粥样硬化甚至癌症等,正在严重威胁着人类健康[1-3]。秀丽线虫作为一种新兴的肥胖研究模型,越来越多地被运用到肥胖相关研究中[4]。作为肥胖研究模式生物,线虫研究基础成熟,具有生长周期短、个体较小、易于观察及遗传操作方便等优点[4]。哺乳动物中的多数基因在线虫中存在同源基因,哺乳动物中调控脂肪沉积以及相关代谢疾病的调节因子和代谢通路,在线虫中也得到了一定的证实[5]。由于遗传操作简单,线虫中已经构建了众多改变脂肪沉积的突变体,如tph-1、dhs-28、daf-2、rict-1[4,6]。突变的基因可能位于代谢通路的重要位置,如daf-2编码在哺乳动物中同源的胰岛素受体,在胰岛素通路中起重要作用[7]。

在肥胖发生过程中,脂肪沉积的增加与多个生理过程相互作用,受一系列代谢通路以及相关酶类的调节,脂肪沉积机理的研究一直是肥胖相关疾病研究的核心问题,减少脂肪细胞中脂质积累是一种重要的抵抗肥胖的手段[8]。组织蛋白酶是一类裂解肽键的蛋白水解酶,根据其催化中心不同可分为不同类型,包括组织蛋白酶B(cathepsin B)、组织蛋白酶D(cathepsin D)和组织蛋白酶L(cathepsin L)等[9]。研究表明,组织蛋白酶参与了肥胖及相关代谢疾病的发生和发展过程[10-13],比如降低组织蛋白酶L的表达可以有效抑制脂肪沉积的增加[9]。组织蛋白酶B是溶酶体内半胱氨酸内切蛋白水解酶,其作用非常广泛,参与机体多种生理、病理过程[14-15]。当前,对于组织蛋白酶B的研究主要是关于炎性、癌症[14],组织蛋白酶B在脂肪沉积中的作用还不清楚。

在线虫中存在多个与哺乳动物组织蛋白酶B同源的基因,包括cpr-1、cpr-2、cpr-3、cpr-4、cpr-5和cpr-6[16-19]。本文拟以秀丽线虫为研究对象,分析脂肪沉积改变过程中,组织蛋白酶B同源基因的表达变化及其在脂肪沉积中的可能作用。

1材料与方法

1.1材料

秀丽线虫购自国际线虫中心CGC;油红O购自Sigma公司;RNAiso Plus 试剂、Oligo d(T)18、dNTP、SYBR®Premix Ex TaqTMII试剂购自TaKaRa公司；M-MLV 逆转录试剂盒购自Invitrogen公司；氯化钠、蛋白胨、琼脂粉、硫酸镁、氯化钙、葡萄糖等均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2方法

1.2.1线虫培养基的配制

线虫生物培养基(nematode growth medium,NGM)的配制如下:1 L培养基中NaCl 3 g,蛋蛋白胨2.5 g,琼脂粉17 g,蒸馏水975 mL,121 ℃灭菌30 min后冷却至50～60 ℃,加过滤灭菌的1 mol/L MgSO4、CaCl2各1 mL、5 mg/mL 胆固醇1 mL、30 mg/mL链霉素1 mL以及25 mL K2HPO4/KH2PO4缓冲液。

高糖培养基5 mmol/L,每升培养基加5 mL葡糖糖(1 mol/L),高胆固醇培养基加3倍的胆固醇。RNA干扰(RNA interference,RNAi)培养基在加抗生素上有区别,分别为100 mg/mL氨苄青霉素、15 mg/mL四环素、0.4 mol/L诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)各1 mL。

1.2.2线虫的培养

NGM培养基上加浓缩OP50菌液,37 ℃培养12 h,再将同步化后线虫接于培养基上20 ℃培养,显微镜下观察线虫的生长状况,线虫生长至成虫,即同步化后52 h后收取备用。

1.2.3线虫的 RNA干扰

溶菌肉汤(lysogeny broth,LB)液体培养基中加氨苄青霉素和四环素,然后接种含有L4440空载体以及含有能够合成cpr-3 dsRNA的HT115细菌,摇床上摇动12 h后再进行IPTG诱导。进行RNAi培养时,在RNAi NGM培养板上分别接种L4440菌与cpr-3干扰菌,37 ℃培养12 h。将同步化后线虫接于培养基上20 ℃培养,其余步骤与普通培养时相同。

1.2.4油红染色

培养至成虫的线虫,用M9洗下收集于EP管中,用M9洗2遍,冰上孵育10 min,10%的甲醛固定,-80 ℃保存备用。从超低温冰箱取出线虫反复冻融3次,最后一次于冰上融化。M9洗2遍,再用100%的1,2-丙二醇润洗2 min,加入0.5%油红染色于摇床上以200 r/min摇12 h,染色结束后吸出染液,加入85%的1,2-丙二醇。85%丙二醇于脱色摇床上摇晃5 min 3次,离心后移去,加入M9制片,于倒置显微镜下观察线虫脂肪沉积情况并拍照。拍照完成后吸净M9,加入200 μL无水乙醇,于脱色摇床摇晃15 min,使油红溶出。每管吸出150 μL至96孔板中,检测OD510[20]。

1.2.5类组织蛋白酶基因表达的检测

收集各组处理过的线虫,每组3 000条,用RNAiso Plus 试剂提取总RNA,取2 μg总RNA利用反转录酶试剂盒反转录成cDNA,并用实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法检测类组织蛋白酶相关基因的mRNA表达,各基因引物见表1所列。

以act-1作为内参照,分别计算各组2-ΔΔCt,用以表示各基因的mRNA相对表达量。实时荧光定量PCR的反应条件为退火温度60 ℃,重复40个循环。

表1　实时荧光定量PCR的引物序列

1.2.6统计学处理

所有数据以“均数±标准差”表示(重复试验3次,每次试验每组2板线虫)。采用SPSS13.0统计软件,进行不同组之间的t检验,双侧P<0.05 为统计学意义的显著差异。**表示0.01

2结果分析

2.1类组织蛋白酶B基因mRNA的表达

在高糖/高胆固醇饮食诱导下,高浓度葡萄糖和胆固醇诱导对线虫脂肪沉积影响如图1所示。

ND—普通饮食　HGD—高葡萄糖饮食　HCD—高胆固醇饮食

由图1可看出,随着葡萄糖和胆固醇量的增加,线虫脂肪沉积显著增加。在脂肪沉积增加后线虫组织蛋白酶B基因mRNA的表达量也发生了变化,如图2所示。

基因

图2不同饮食N2线虫中类组织蛋白酶B相关基因的表达

由图1、图2可知,在高葡萄糖/高胆固醇饮食诱导下线虫脂肪沉积发生了显著变化,但是cpr-1、cpr-4以及cpr-6的表达量改变不明显;cpr-2在高胆固醇诱导下表达量显著升高,但在高糖诱导下表达没有显著改变;cpr-5的表达量在高糖诱导下显著升高,但不受高胆固醇诱导的影响;cpr-3在高糖和高胆固醇的诱导下表达量均显著升高。

由以上分析可知,本文利用高葡萄糖/高胆固醇饮食诱导脂肪沉积增加的模型,分析了组织蛋白酶B同源基因的表达变化,发现只有cpr-3的表达在2种饮食诱导的脂肪沉积增加过程中显著上升。

线虫中存在特定的突变体,其遗传背景改变后脂肪沉积增加,tph-1、dhs-28、daf-2以及rict-1突变体较野生型N2线虫脂肪沉积增加。本文利用实时荧光定量PCR检测这几种突变体的组织蛋白酶B同源基因的表达,如图3所示。

由图3可知,cpr-1在突变体dhs-28中表达量显著增加,但在突变体rict-1中表达量显著减少,在其他2个突变体中,较野生型表达量无变化;4种突变体中cpr-2的表达,除在tph-1突变体中无变化,其他3个突变体中均显著升高;与饮食诱导时相似,在检测的突变体中cpr-4的表达量均无显著变化;cpr-5的表达量虽然在突变体tph-1中显著上升,但在突变体daf-2中显著下降,其他2个突变体中的表达无显著变化;cpr-6在突变体dhs-28中表达量显著上升,突变体rict-1中表达显著降低,其他2个突变体中的表达无显著变化;cpr-3的表达量在4种突变体中均显著升高。因此,只有cpr-3的表达量在所有检测的脂肪沉积增加的突变体中,均显著升高。

图3　突变体线虫中类组织蛋白酶B相关基因mRNA的相对表达量

2.2RNAi对线虫脂肪沉积的影响

鉴于cpr-3的表达在所有脂肪沉积增加的模型中均显著增加,本文利用RNAi技术降低了cpr-3的表达,并研究其在脂肪沉积中的作用。对照组的RNAi饲喂L4440菌,即在HT115中转入空载质粒的大肠杆菌,其相对表达量结果如图4a所示,实时荧光定量PCR的结果表明,在RNA干扰后，cpr-3表达量显著下降,说明RNA干扰成功。

在cpr-3表达量下降后,本文利用油红O染色的方法检测了线虫的脂肪沉积情况,然而RNA干扰cpr-3后,线虫脂肪沉积与对照比较几乎无变化,如图4b、图4c所示。由图4b、图4c可看出,降低cpr-3表达量不能使脂肪沉积减少。因此,cpr-3表达的改变可能是线虫脂肪沉积改变的结果,而不是引起线虫脂肪沉积改变的原因。

图4　cpr-3表达量降低对线虫脂肪沉积的影响

3讨论

超重和肥胖是引起死亡的重要风险,肥胖的本质是脂质在脂肪细胞中过度积累,减少脂质积累可有效预防和治疗肥胖及其相关威胁机体健康的疾病[21]。对于肥胖及其相关疾病问题的研究,可以从个体、组织、细胞及分子等各个水平进行研究,但归根结底肥胖发生的分子机制研究是解决肥胖及相关疾病的根本。当前的研究发现,脂肪沉积过程伴随着一系列分子水平的改变,而且这些分子也可能反过来调节脂肪沉积。研究这些分子有利于预防和治疗肥胖及其相关疾病。

近年来研究表明,组织蛋白酶被认为是在癌症、免疫系统相关疾病中起作用的一类关键酶[22],组织蛋白酶类与肥胖及其相关疾病具有密切关系[5]。本实验以秀丽线虫为研究对象,研究组织蛋白酶B与线虫脂肪沉积的关系。实验结果显示,在高糖诱导线虫脂肪沉积增加时,cpr-3、cpr-5的表达量上升;高胆固醇诱导线虫脂肪沉积增加时,cpr-2、cpr-3的表达量升高;在饮食诱导线虫脂肪沉积试验中,其他基因的表达量与对照相比均无显著变化。在daf-2突变体中cpr-2、cpr-3表达量升高,cpr-5表达量下降;在dhs-28突变体中cpr-1、cpr-2、cpr-3、cpr-5表达量上升;在rict-1突变体中cpr-2、cpr-3表达量升高,cpr-1、cpr-6表达量下降;在tph-1突变体中cpr-2、cpr-3表达量升高,cpr-3、cpr-5表达量下降。cpr-3表达量在饮食诱导以及突变体线虫中均有显著的增加,可能是由于cpr-3是线虫中与脂肪沉积密切相关的关键组织蛋白酶B基因的存在。然而利用RNAi技术降低cpr-3的表达后,线虫脂肪沉积没有发生改变,这说明cpr-3表达的改变是线虫脂肪沉积变化的结果。

4结束语

本研究表明线虫脂肪沉积增加可以改变类组织蛋白酶B相关基因的表达,特别是cpr-3的表达显著升高,而RNAi降低cpr-3表达不能改变线虫的脂肪沉积。因此cpr-3表达的改变可能是线虫脂肪沉积改变的结果,而不是引起线虫脂肪沉积改变的原因。

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(责任编辑闫杏丽)

Study of expression and function of Cathepsin B in the process of fat storage in Caenorhabditis elegans

ZHAO Li-juan,BAO Bin

(School of Biotechnology and Food Engineering,Hefei University of Technology,Hefei 230009,China)

Abstract:In this paper,Caenorhabditis elegans(C.elegans)were fed with high concentration glucose and cholesterol diet,and it was demonstrated that the fat storage increased dramatically by oil red O staining. In order to study the role of Cathepsin B Protease homologous genes in the fat storage process of C.elegans,their expression was investigated by quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR).The cpr-3 was proposed as a critical gene homologous to Cathepsin B Protease,and then the effect of selected critical genes on the fat storage in C.elegans was studied by RNAi technology. The results show that the altered expression of Cathepsin B Protease homologous genes maybe a result of the changed fat storage in C.elegans. However,there is no change of fat storage when cpr-3 is knocked down by RNAi. In consequence,homologous genes of Cathepsin B Protease do not directly regulate the fat storage,but may participate in the physiological and pathological processes after the increase of fat storage.

Key words:Cathepsin B Protease;Caenorhabditis elegans(C.elegans);fat storage;gene expression

收稿日期：2015-02-11；修回日期：2015-04-10

基金项目：安徽省自然科学基金资助项目(1408085QC48)

作者简介：赵丽娟(1990-),女,安徽宿州人,合肥工业大学硕士生;

doi:10.3969/j.issn.1003-5060.2016.06.026

中图分类号:Q493.5

文献标识码：A

文章编号：1003-5060(2016)06-0849-05

鲍斌(1983-),男,河北石家庄人,博士,合肥工业大学讲师,硕士生导师.