黄芪多糖注射液联合吉非替尼对肺癌患者组织P53及Ki-67蛋白表达的影响

虞义建，甘梅富

(浙江省台州医院 病理科，浙江 台州 317000)

黄芪多糖注射液联合吉非替尼对肺癌患者组织P53及Ki-67蛋白表达的影响

虞义建Δ，甘梅富

(浙江省台州医院 病理科，浙江 台州 317000)

目的 探讨黄芪多糖注射液联合吉非替尼对肺癌患者组织中P53及 Ki-67蛋白表达的影响。方法 选取非小细胞肺癌患者67例，按治疗方法不同分组，对照组28例口服吉非替尼，研究组39例在吉非替尼基础上加用黄芪多糖注射液，免疫组化法测定治疗前后组织Ki-67及P53蛋白水平，同时测定T淋巴细胞亚群变化。结果 研究组有效率、疾病控制率与对照组比较差异无统计学意义。研究组治疗后P53阳性率显著高于对照组， Ki-67阳性率显著低于对照组(均P<0.05)。研究组治疗后CD3+T、CD4+T低于对照组，CD8+T、CD4+T/CD8+T高于对照组(均P<0.05)。结论 采用黄芪多糖注射液联合吉非替尼对肺癌患者组织降低Ki-67及提高P53蛋白表达的效果显著。

黄芪多糖注射液；吉非替尼；肺癌；Ki-67；P53

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率呈逐年上升趋势，发病率居世界首位[1]，严重危害人类的健康。多数确诊患者已属中晚期,失去手术治疗的最佳时机[2]。目前靶向药物治疗制剂吉非替尼为肺癌患者带来了新的希望，然而部分患者毒副反应较大，不能明显延长生存期。应施予多学科综合治疗中晚期肺癌，以提高疗效，延长生存期及提高生存质量。增殖核抗原Ki-67能准确反映肿瘤细胞的增殖活性，并与多种肿瘤的发展、转移及预后有关[3]。P53基因参与肿瘤发生、发展的周期调控,其表达使肿瘤细胞发生不可逆凋亡,若缺失或突变与肿瘤的发生高度相关[4]。目前关于黄芪多糖注射液联合吉非替尼对肺癌患者组织中Ki-67及P53蛋白表达影响的相关研究较少，本次研究报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年10月～2015年7月来浙江省台州医院治疗的肺癌患者67例，经病理组织学确诊，排除存在肝肾功能、心电图异常，存在化疗禁忌症患者，按治疗方法不同分组，对照组28例口服吉非替尼治疗，男16例，女12例，年龄62～74岁，平均年龄(65.1±6.8)岁，TNM分期Ⅲ期19例，Ⅳ期9例；研究组39例在吉非替尼基础上加用黄芪多糖注射液，男22例，女17例，年龄61～75岁，平均年龄(65.4±6.7)岁，TNM分期Ⅲ期25例，Ⅳ期14例，2组具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法：对照组患者口服吉非替尼250 mg/d，28 d 1个周期。研究组在吉非替尼基础上加用黄芪多糖注射液250 mg加入0.9%NaCl 500 mL中静滴，1次/天，28 d 1个周期。

1.2.2 免疫组化检测：试剂：单克隆抗体Ki67和P53及Envision TM+试剂盒(K40004)；水性封片胶购自DAKO公司。

操作过程：肺癌组织和癌旁组织石蜡切片，经10%缓冲甲醛内固定，切片4 μm。二甲苯Ⅰ、Ⅱ浸泡15 min，无水乙醇、95%乙醇、70%乙醇中浸泡3 min，流水冲洗5 min。PBS液中震荡仪震荡5 min/次×3。抗原用微波修复10 min后让其自然冷却至室温，蒸馏水洗涤后再用PBS液震荡仪震荡5 min/次×3。滴加第一抗体(Ki-67、P53)，室温下孵育15 min。PBS液震荡仪震荡5 min/次×3。滴加mouse En VisionTM，室温下孵育30 min。PBS液震荡仪震荡5 min/次×3。滴加DAB显色，37 ℃反应30 min后观察显色。苏木素复染，脱水、透明、树脂胶封片，记录显色情况。

1.2.3 观测指标：临床疗效：完全缓解(SD)为瘤体消失，持续时间大于1个月；部分缓解(PR)为瘤体2个月最大相互垂直直径乘积缩小>50%，持续时间大于1个月；稳定(SD)为瘤体2个月最大互相垂直直径乘积缩小<50%；或增大<25%，持续时间大于1个月；恶化(PD)为瘤体2个最大互相垂直直径乘积增大>25%。有效率=(完全缓解+部分缓解)/总例数×100%；疾病控制率=(完全缓解+部分缓解+稳定)/总例数×100%。

Ki-67及P53蛋白：采用免疫组化测定治疗前后病理组织，计算Ki-67及P53蛋白阳性细胞百分率。阳性细胞数<10%为阴性(-),10%～25%为弱阳性(+),26%～50%为阳性(++)、>50%为强阳性(+++)。

免疫功能：治疗前、后采用美国BD公司的FACSCalibur流式细胞仪动态监测T淋巴细胞亚群(CD3+T、CD8+T、CD4+T、CD4+T/CD8+T)变化。

2 结果

2.1 2组患者治疗后临床效果分析 研究组有效率与对照组比较差异无统计学意义(51.3%vs.46.4%，χ2=0.154，P=0.885)，研究组疾病控制率与对照组比较差异无统计学意义(76.9%vs.64.3%，χ2=1.28，P=0.256)。见表1。

表1 2组患者治疗后临床效果分析[n(%)]

2.2 2组患者治疗前后组织Ki-67及P53蛋白表达状况 Ki67、P53蛋白以细胞核呈现棕黄色颗粒为阳性，其免疫组化结果见图1。

图1 Ki67、P53蛋白免疫组化结果(×100)Fig.1 Immunohistochemistry of Ki67 and P53 protein(×100)

研究组治疗前P53阳性率与对照组比较差异无统计学意义(51.28%vs.50.00%，Z=0.419,P=0.675)；研究组治疗后P53阳性率显著高于对照组(79.49 %vs.57.14%，Z=2.331,P=0.020)。

研究组治疗前Ki-67阳性率与对照组比较差异无统计学意义(71.79%vs.71.43%，Z=0.302,P=0.763)，研究组治疗后Ki-67阳性率显著低于对照组(35.90%vs.60.71%，Z=2.193,P=0.028)。见表2、表3。

表2 2组患者治疗前后组织P53蛋白表达比较

表3 2组患者治疗前后组织Ki-67蛋白表达比较

2.3 2组患者治疗前后2组T细胞亚群变化 与治疗前比，研究组治疗后CD3+T、CD4+T下降，CD8+T、CD4+T/CD8+T升高(P<0.05)，研究组治疗后CD3+T、CD4+T低于对照组，CD8+T、CD4+T/CD8+T高于对照组(P<0.05)。见表4。

组别 例数时间点CD3+(%)CD8+(%)CD4+(%)CD4+/CD8+对照组28治疗前61 20±6 8243 75±5 2933 97±5 650 86±0 29治疗后62 37±6 4441 47±4 3834 54±4 980 89±0 32研究组39治疗前60 94±7 0144 54±5 7334 18±5 470 85±0 31治疗后72 91±7 83∗#35 82±4 41∗#41 86±4 81∗#1 21±0 27∗#

*P<0.05，与同组治疗前比较，compared with the same group pre-treatment；#P<0.05，与对照组治疗后比较，compared with control group post-treatment

3 讨论

肺癌是发病率、死亡率均很高的一种恶性肿瘤，对人类威胁日益严重，我国肺癌的发病率有明显增高趋势。多数肺癌患者确诊时已属晚期，尽管近年来化疗和放疗技术有了长足进步，但患者长期生存率并未得到明显提高。因此，迫切需要探讨新的有效治疗措施。目前一些小分子的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂已应用于晚期NSCLC治疗并取得了巨大的进展[5]。吉非替尼是具有代表性的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂，对多种肿瘤细胞株生长有抑制作用[6],从而达到抑制细胞周期进程、加速细胞凋亡、抑制血管生成、抑制肿瘤细胞浸润和转移，增强化、放疗效果的作用。研究表明吉非替尼能够快速改善浆膜腔积液非小细胞肺癌患者的临床症状，显著提高患者的生活质量改善幅度[7]。黄芪多糖可以可以提高患者机体的免疫水平[8]，往往可以起到抗肿瘤并提高免疫力的作用。近年来发现Ki-67和P53蛋白在肺癌和肺部良性病变的患者中差异较大,有助于临床对患者进行早期诊断。目前关于黄芪多糖注射液联合吉非替尼对肺癌患者组织中Ki-67及P53蛋白表达影响较少，本次研究探讨黄芪多糖注射液联合吉非替尼对肺癌患者组织中Ki-67及P53蛋白表达影响。

研究表明化疗在灭杀肿瘤细胞的同时，会对机体造成一定程度的损伤[9]。黄芪主要含有多糖、皂苷、氨基酸、生物碱等成分，具有补益中气、扶正固本的疗效。研究显示黄芪多糖可在体外诱导DC成熟,并促进其抗原递呈能力,有效活化CTL,增强机体抗肿瘤功能[10]。本次研究发现研究组治疗后CD3+T、CD4+T低于对照组，CD8+T、CD4+T/CD8+T高于对照组(P<0.05)，说明中药能够作用于全身免疫系统，即促进免疫细胞的生成及细胞因子的分泌，提高细胞抗肿瘤的免疫功能。

Ki67是增殖性细胞核的标记物,代表细胞增殖水平，且能可靠而迅速地反映恶性肿瘤增殖率的指标,其高表达是细胞增殖活跃的重要标记。P53是人类恶性肿瘤中最常见的突变基因,与人类肿瘤的发生相关性最高[11]。P53基因,可与多种分子协同促进肺癌恶性进展[12]。本次研究发现研究组治疗后P53阳性率显著高于对照组，研究组治疗后Ki-67阳性率显著低于对照组(P<0.05)。说明黄芪多糖注射液联合吉非替尼对肺癌患者组织降低Ki-67表达，提高P53蛋白表达，间接说明二者合用对肺癌发生及转归有重要的影响。

本次研究发现采用黄芪多糖注射液联合吉非替尼对肺癌患者组织降低Ki-67表达，提高P53蛋白表达，效果显著。本次由于人数及时间限制，对于黄芪多糖注射液联合吉非替尼通过何种机制对组织中Ki-67及P53蛋白表达起到靶向作用尚不清楚，需要进一步研究。

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(编校：王俨俨)

Effect of astragalus polysaccharide injection combined with gefitinib on tissue P53 and Ki-67 expressions in patients with lung cancer

YU Yi-jianΔ, GAN Mei-fu

(Department of Pathology, Taizhou Hospital of Zhejiang, Taizhou 317000, China)

ObjectiveTo explore the effect of astragalus polysaccharide injection combined with gefitinib on tissue P53 and Ki-67 expressions in patients with lung cancer.Methods67 cases of non-small cell lung cancer were selected and divided into two groups according to different therapy, control group of 28 cases

gefitinib orally, and study group of 39 cases received astragalus polysaccharide injection combined with gefitinib. The expressions of tissue P53 and Ki-67 were detected immunohistochemical method pre-and post-treatment and the T T lymphocyte subsets were detected at the same time. ResultsThere were no significant difference in rates of effectiveness and disease control between study group and control group. Compared with control group, the positive rate of P53 was higher and the positive rate of Ki-67 was lower post-treatment in study group (allP<0.05). Compared with control group, the CD3+T and CD4+T were lower, the CD8+T,CD4+T /CD8+T were higher post-treatment in study group (allP<0.05).ConclusionThe treatment of astragalus polysaccharide injection combined with gefitinib could significantly reduce tissue Ki-67 and increase tissue P53 expressions in patients with lung cancer.

astragalus polysaccharide injection; gefitinib; lung cancer; Ki-67; P53

虞义建，通信作者，男，本科，主治医师，研究方向：肿瘤病理，E-mail：poyisb@163.com。

R734.2

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.03.47