12株禽痘疫苗毒中禽网状内皮组织增生病病毒5′LTR整合位点的比较研究

孔祥伟，王 丹，王世新，王海明，杨树青，孙淑红



12株禽痘疫苗毒中禽网状内皮组织增生病病毒5′LTR整合位点的比较研究

孔祥伟＃，王 丹＃，王世新，王海明，杨树青，孙淑红*

（山东农业大学动物科技学院，泰安271018）

摘 要：为探究近年来禽痘（FP）疫苗中禽网状内皮组织增生病病毒（REV）5′长末端重复序列（LTR）的整合情况，收集2012—2014年不同地区不同批次的12株FP疫苗，稀释后接种鸡胚成纤维细胞（CEF），提取细胞DNA，扩增REV相关基因并测定序列。结果表明，12个禽FP疫苗株均扩增出含REV－5′LTR和FPV片段在内的产物，其中2株国外疫苗扩增序列长度为745bp，10株国产疫苗扩增序列长度为485bp。经DNA－Star比对分析，2株国外疫苗整合了446bp的几乎完整的REV－LTR序列，另外10株国产疫苗整合的REV－LTR片段相对较小，仅为194 bp。这12个FP疫苗株中整合的REV－LTR与中国近年分离到的REV野毒株HA1101的LTR的相似性为70.3%～82.6%，与国外已发表的FP毒株AY255632整合的REV－LTR的相似性高达98.6%～100%。结果提示，国内外FP疫苗整合有REV－LTR序列的现象普遍存在。本研究检测的12个FP疫苗株均整合有REV－LTR序列，一部分疫苗株整合了几乎完整的REV－LTR序列，而大部分疫苗株整合片段则相对较小，并且与国外已分离到的FP毒株的序列同源性更接近。

关键词：禽痘疫苗；禽网状内皮组织增生病病毒；5′LTR

禽痘（fowl pox，FP）是由痘病毒科、脊椎动物痘病毒亚科、禽痘病毒属中的禽痘病毒（fowl pox virus，FPV）引起的家禽的一种急性、接触性传染病。FPV感染鸡只在临床上主要表现为皮肤型、白喉型，或者混合型3种类型。目前，世界范围内使用FP疫苗接种的方式已经对FPV的传播起到了很好的控制作用。然而，近年来，该病由于FPV基因组的变异以及与其他病毒的重组现象的发生又以新的形式暴发。丁家波等［1］在2004年首次报道FPV基因组中整合有禽网状内皮组织增生病病毒（reticuloendothliosis virus，REV）基因以来。近几年陆续有分离到的FPV野毒株中含有REV前病毒全基因序列，疫苗株整合有REV的LTR（long terminal repeats）片段或者是全基因序列的报道［2－4］。目前，FP的高发病率和免疫失败，给FP的防治工作带来了新的挑战。作者选取10株国产FP疫苗株及2株国外FP疫苗株，对不同疫苗厂家生产的FP疫苗株中REV－LTR序列进行对比分析，了解FP疫苗中整合REV序列的情况，同时进一步比较国内及国外FP疫苗整合REV序列的差异，为有效预防FP及RE提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 疫苗株及主要试剂

12个FPV疫苗株购自2012－2014年国内外不同批次、不同地区的生产厂家，编号为C1～C10、F1～F2，其中F1～F2为国外疫苗。pMD18－T、DNA Marker DL2000和DL15000均购自TaKaRa公司；胶回收试剂盒购自美国Biomiga公司；质粒提取试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；感受态细胞Trans－5α购自北京全式金公司；其他常规试剂均为国产分析纯。

1.2 实验鸡胚

SPF鸡胚购自济南赛斯家禽有限公司。

1.3 PCR用DNA模板的制备

将12个不同地区不同批次的禽痘疫苗产品分别以5mL PBS稀释后接种长至单层的CEF，培养至出现80%细胞病变时，将细胞消化收获，提取细胞DNA。以所提取的DNA为模板，使用特异性引物进行PCR扩增。

1.4 引物设计及PCR反应程序

合成一对上下游分别来自FPV的ORF201和ORF203用于扩增FPV－REV 5′LTR整合区的引物［2］，引物序列：5′－AACAATGATACGTCTCTTCC－3′（F）；5′－CACACGAATATACCAATAAGG－3′（R）。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min；56℃退火1min；72℃延伸6min，共30个循环；最后72℃延伸10min。

另外，合成4对用于扩增REV LTR、Env、Gag、Pol的引物，引物序列如下，①Gag－F：5′－TCGGTACAACATTTGGGGGCT－3′，Gag－R：5′－TTAGACATAGGCCCCACAG－3′；②Pol－F：5′－ATTATAGGGGCTACTGGGAAC－3′，Pol－R：5′－TGCTCGCCTGGTCAACTTTAC－3′；③Env－F：5′－ATGGACTGTCTCACCAACCT－3′，Env－R：5′－TTGACCTAGGGTATCCATCT－3′；④LTR－F：5′－AATGGTTGTAAAGGGCAGAT－3′，LTR－R：5′－CTCCTCTCACTGCCAATCT－3′。

GagPCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性5min；52℃退火30s；72℃延伸2.5min，共30个循环；最后72℃延伸7min。Pol PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s；53℃退火30 s；72℃延伸4min，共30个循环；最后72℃延伸10 min。Env PCR反应条件：95℃预变性3min；95℃变性1min；60℃退火30s；72℃延伸1.5min，共30个循环；最后72℃延伸5min。LTRPCR反应条件：95℃预变性3min；95℃变性1min；60℃退火30s；72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃延伸5min。

1.5 PCR产物纯化

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，并采用胶回收试剂盒回收、克隆于pMD18－T载体中由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.6 测序及基因分析

对10个FP疫苗株和随机挑选的4个分离株进行测序，测序结果采用DNA－Star软件进行序列拼接、比对、同源性分析并生成基因进化树。

2 结 果

2.1 FPV疫苗株中REV整合区的PCR扩增

以接种疫苗的CEF抽提cDNA为模板，采用特异性引物对FPV－REV 5′LTR整合区进行扩增。12个FP疫苗株均扩增出含REV－5′LTR和FPV片段在内的产物，其中10个国内疫苗株片段长度约为500bp，2个国外疫苗株片段长度较国产疫苗长，约为800bp。结果见图1。

2.2 禽痘疫苗整合区测序结果及其序列分析

2.2.1 国产禽痘疫苗整合区序列分析 测序结果表明，10个国产FP疫苗株的序列长度为485bp，经DNA－Star比对分析表明，10个国内疫苗株整合的REV－LTR片段为194bp且高度同源，与中国近年分离到的REV野毒株HA1101、HA9901的相似性分别为98.5%和96.4%，与美国REV标准株SNV的相似性为94.3%（详细数据略）。其基因进化树结果见图2。

图1 禽痘疫苗整合区PCR凝胶电泳Fig.1 Amplification of REV integrated regions of FPV vaccine by PCR

图2 国产禽痘疫苗株整合REV－LTR基因进化树Fig.2 Genetic evolution tree of integrated LTRfor FPV vaccine strains of China

10个国产FP疫苗株整合区与国外已发表的FP毒株AY255632、HP－438［Munich］中的REV－LTR的相似性分别为98.6%和100%。其基因进化树结果见图3。

图3 国产禽痘疫苗株整合REV－LTR基因进化树Fig.3 Genetic evolution tree of integrated sector for FPV vaccine strains

2.2.2 国外禽痘疫苗整合区序列 测序结果表明，2个国外FP疫苗株的序列长度为745bp，经DNA－Star比对分析表明，整合的REV－LTR片段为446bp，大于国产FP疫苗株。与中国近年分离到的REV野毒株HA1101、HA9901的相似性为98%，与美国REV标准株SNV的相似性为94.3%。但整合区与AY255632中的REV－LTR相似性达到100%（图略）。

2.3 FPV疫苗株中REV Env、Gag、Pol基因的PCR扩增

12个FP疫苗株均未扩增到REV的Env、Gag、Pol基因，表明所检测疫苗只整合REV－LTR序列，并未有REV其他基因序列的插入（图略）。

3 讨 论

禽痘（FP）是由禽痘病毒（FPV）引起的一种接触性传染病，能够感染不同品种和日龄的鸡，但是对雏鸡的易感性最高。FPV感染鸡只在临床上主要表现为皮肤型、黏膜型以及混合型3种类型。禽网状内皮组织增生症（RE）是由逆转录病毒科的禽网状内皮组织增生症病毒（REV）引起的鸡、鸭、火鸡和其他禽类的一种以淋巴－网状细胞增生为特征的肿瘤性病理综合征。以引起免疫抑制及死亡为特征。目前，REV基因片段整合进FP疫苗、基因片段甚至完整的基因组整合进FPV野毒株已成为普遍现象，国内外均对此有报道［1－6］。在21世纪90年代末期，美国和澳大利亚先后发现FP疫苗中污染有REV，澳大利亚学者还发现痘病毒疫苗的基因组中整合了REV前病毒的LTR序列，随后，不断有学者报道这一整合现象。丁家波等［1］于2004年首次证明了疫苗株和野毒株都整合有REV基因成分。于立娟等［2］首次对我国疫苗株和野毒株插入的REV－LTR的整合位点进行了分析。尽管越来越多的人倾向于鸡痘的高发率、鸡痘疫苗的免疫失败及患痘鸡的后续病症可能与REV基因整合进FPV有关，但整合REV基因的FPV的毒力是否因此改变，目前尚未见相关的研究报道。同时由于REV污染了FP疫苗导致FPV免疫鸡群REV感染或FP免疫失败的现象偶有发生，2010年，王景艳等［7］用PCR和IFA方法首次从禽痘弱毒疫苗中分离到REV活毒。FP疫苗中存在传染性的REV会造成疫苗接种过程中REV的感染，从而导致严重的经济损失，这一现象应该引起高度重视。

本研究对收集的2012—2014年国内外不同地区、不同批次的12个FP疫苗株进行了热点整合区序列的扩增以及REV LTR、Env、Gag、Pol片段的扩增，结果只扩增出了REV－LTR一部分片段，并且10株国产疫苗的扩增片段小于国外进口疫苗（国产疫苗插入片段长度为194bp，国外疫苗插入片段为446bp），这与之前的报道相符。12株疫苗都没有扩增出REV的其他片段，表明所研究的疫苗只整合了REV的部分序列，并且根据测序结果及同源性比较，扩增出的REV片段与REV标准分离株HA9901、HA1101和REV标准株SNV的同源性并不高，但与国外报道的FPV整合区高度同源。由此推测，FP疫苗株也可能最初从国外引进时就已整合了REV－LTR，只是在国内生产过程中发生了极少的变异。

但目前FP的高发病率是否由于FPV野毒株的毒力增强，从而导致FP疫苗的免疫保护力下降？同时，目前国内外广泛应用FP疫苗均整合有部分REV－LTR序列，这是否成为免疫保护性下降的原因有待于进一步探讨。

参考文献（References）：

［1］ 丁家波，崔治中，于立娟，等.含有禽网状内皮组织增生病病毒基因组片断的天然重组禽痘病毒的研究［J］.微生物学报，2004，44（5）：588－592.DING J B，CUI Z Z，YU L J，et al.Detection of reticuloendotheliosis virus genomic sequence in the genome of field and vaccine strains of fowl poxvirus［J］.Acta Microbiologica Sinica，2004，44（5）：588－592.（in Chinese）

［2］ 于立娟，崔治中.禽痘疫苗病毒中网状内皮组织增生病病毒5′LTR整合位点序列分析［J］.微生物学报，2006，46（4）：660－662.YU L J，CUI Z Z.Sequence analysis of integration sites of reticuloendotheliosis virus LTR in fowlpox vaccine virus genomes［J］.Acta Microbiologica Sinica，2006，46（4）：660－662.（in Chinese）

［3］ 陈 静.禽痘病毒基因组中整合有禽网状内皮组织增生病病毒序列的研究［D］.扬州：扬州大学，2006.CHEN J.Reticuloendotheliosis virus sequence integrated into the fowlpox virus genomes of field strain and vaccine strain［D］.Yangzhou：Yangzhou University，2006.（in Chinese）

［4］ 车国喜，孙洪磊，于 宏，等.鸡痘病毒分离株及疫苗株整合网状内皮组织增生病病毒的基因分析［J］.中国预防兽医学报，2012，34（11）：864－868.CHE G X，SUN H L，YU H，et al.Sequence analysis of the sequence of reticuloendotheliosis virus integrated in the genome of fowl poxvirus vaccine strains and isolates［J］.Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine，2012，34（11）：864－868.（in Chinese）

［5］ HERTIG C，COUPAR B E，GOULD A R，et al.Field and vaccine strains of fowlpox carry integrated sequences from the avian retrovirus，reticuloendotheliosis virus［J］.Virology，1997，235（2）：367－376.

［6］ FADLY A，GARCIA M C.Detection of reticuloendotheliosis virus in live virus vaccines of poultry［J］.Dev Biol（Basel），2006，126：301－305.

［7］ 王景艳，李中明，赵 鹏，等.禽痘病毒活疫苗中网状内皮组织增生病病毒的分离鉴定及其序列比较［J］.中国动物传染病学报，2010，18（1）：35－39.WANG J Y，LI Z M，ZHAO P，et al.Isolation of reticuloendotheliosis virus from a fowlpox live vaccine and env gene sequence analysis［J］.Chinese Journal of Animal Infectious Diseases，2010，18（1）：35－39.（in Chinese）

（编辑 白永平）

Comparative Analysis of Integration Sites of Reticuloendotheliosis Virus 5′LTR in 12Fowl Pox Vaccine Strains

KONG Xiang－wei＃，WANG Dan＃，WANG Shi－xin，WANG Hai－ming，YANG Shu－qing，SUN Shu－hong*
（Animal Science and Technology College，Shandong Agricultural University，Tai′an 271018，China）

Abstract：To study the integration sites of avian reticuloendothliosis virus（REV）5＇long terminal repeat（LTR）in fowl pox virus（FPV）vaccine strains in recent years，12different batches of FPV vaccines in different regions from 2012to 2014were collected for study.All vaccines were diluted and inoculated into chicken embryo fibroblast（CEF），DNA was extracted for the amplification and sequencing of REV relating genes.（Result）The results showed that both REV－5′LTR and FPV fragments existed in the 12FPV vaccine strains.To be specific，745bp in the 2abroad vaccine strains and 485bp in the other 10domestic vaccine strains.By DNA－Star analysis，446bp as almost the entire REV－LTR were integrated in the 2abroad vaccine strains，while，apart of the REV－LTR fragment about 194bp were integrated in the 10domestic vaccine strains.The integrated REV－LTR sequence among the 12FPV vaccine strains had 70.3%－82.6%homology with the Chinese reference strain HA1101.But it had as high as 98.6%－100%homology with REVLTR in the published abroad PFV strain AY255632.The results suggested that the phenomenonof the integration of REV－LTR sequence in FP vaccine is common at home and abroad.In our study，the 12fowl pox vaccine strains were all integrated with REV－LTR sequence，part of the FPV vaccine strains were integrated with the complete REV－LTR sequence.While the fragment in most FPV vaccine strains was relatively small，and these sequences have a closer homology to the abroad FPV.

Key words：fowl pox vaccine；reticuloendothliosis virus；5′LTR

中图分类号：S852.659.1

文献标志码：A

文章编号：0366－6964（2016）05－1062－05

doi：10.11843/j.issn.0366－6964.2016.05.026

收稿日期：2015－10－10

基金项目：山东省科技发展计划（2014GNC110006）

作者简介：孔祥伟（1989－），女，山东肥城人，硕士，主要从事禽病学研究，E－mail：xiangweik0909@163.com；王 丹（1990－），女，山东莱州人，硕士生，主要从事禽病学研究，E－mail：15215385357@163.com，二人共为同等贡献作者

*通信作者：孙淑红，教授，主要从事家禽病毒病研究，E－mail：sunshuhong@sdau.edu.cn