过表达miR－193b对黑色素细胞中MITF 和TYR表达的影响

张亚玲，许冬梅，杜 斌，谢建山，范瑞文，于秀菊，朱芷葳，董常生*



过表达miR－193b对黑色素细胞中MITF 和TYR表达的影响

张亚玲1，许冬梅2，杜 斌1，谢建山1，范瑞文1，于秀菊1，朱芷葳2，董常生1*

（1.山西农业大学动物科技学院，太谷030801；2.山西农业大学生命科学学院，太谷030801）

摘 要：旨在探讨miR－193b对黑色素生成关键基因MITF和TYR表达的影响，进而说明miR－193b对黑色素形成的影响。本研究通过细胞转染技术，在绵羊黑色素细胞中过表达miR－193b，检测黑色素细胞中黑色素含量的变化，采用实时荧光定量PCR和Western blot分别对转染细胞中MITF和TYR mRNA和蛋白表达水平进行测定。结果显示：过表达miR－193b的黑色素细胞，黑色素含量明显减少；MITFmRNA和TYRmRNA表达均显著降低（P＜0.01），分别降低0.233倍和0.198倍；MITF和TYR蛋白表达量也显著降低（P＜0.01），分别降低0.232倍和0.321倍。本研究表明，过表达miR－193b使黑色素细胞中MITF和TYR表达量降低而间接影响黑色素生成。

关键词：miR－193b；MITF；TYR；黑色素细胞

毛色是哺乳动物重要的外貌特征，也是品种的重要标志和重要的经济性状。动物毛色表型的实现主要是由体内不同黑色素的分布及其相对数量决定的。当黑色素细胞产生的黑素体，被转移并沉积在角化细胞，就形成肉眼可见的毛色［1］。黑色素有两种主要类型：褐黑素和真黑素，两者数目、大小、组成和分布的变化会影响皮肤色素沉着，而二者的比例决定着哺乳动物的毛色和皮色［2］，而黑色素的形成、转移和沉积由众多基因调控。前人研究表明黑色素的形成是由酪氨酸和苯丙氨酸经过一系列氨化酶的催化作用而形成的［34］，其中的酪氨酸酶（TYR）是催化酪氨酸进一步反应的氧化酶，所以TYR是调节黑色素合成的关键酶。而TYR的活性和表达量由相关基因调控，其中起到重要调控作用的基因之一是小眼畸形相关转录因子（Microphthalamia－associated transcription factor，MITF），MITF通过与酪氨酸酶启动子区域结合而调控TYR以及酪氨酸相关蛋白的表达［5］。所以，在研究黑色素生成过程中，TYR和MITF是参与毛色形成，起到重要调控作用的两个关键基因。

miRNA是一类由19～25个核苷酸组成的非编码单链小RNA分子，它可以通过与靶基因mRNA的3′－UTR退火结合以达到对靶基因mRNA的降解或阻碍其翻译的转录后调控［6］。近几年发现，miRNA在多种哺乳动物皮肤中均有表达，并参与这些动物的皮肤形态发生及毛囊的发育过程［7］。例如，miRNA－203被发现对表皮分化有重要影响。Z.Zhu等［8］利用基因芯片技术，构建了不同毛色的羊驼皮肤miRNA表达谱，发现数个在不同毛色差异表达的miRNA，并确定miR－25通过调控MITF的表达参与毛色形成过程。C.S.Dong等［9］通过对miR－137和靶基因MITF的研究，并成功建立miR－137转基因小鼠模型，确定miR－137参与对毛色的调控。X.Tian等［10］运用深度测序技术对不同毛色羊驼进行miRNAs的比对，发现存在48个差异表达的miRNAs，猜测其可能参与毛色调控，其中差异表达较显著的miRNAs有miR－27a、miR－202和miR－193b等。X.N.Gao等［11］研究结果表明，miR－193b可以调控c－kit基因的表达；黑色素生成的通路图提示c－kit是参与黑色素生成过程的重要基因，同时，通过Target Scan软件预测到c－kit为miR－193b的靶基因，提示miR－193b很可能通过调控c－kit基因的表达从而参与调节毛色的生成，而黑色素生成过程中，TYR和MITF是参与毛色形成，起到重要调控作用的两个关键基因。笔者推测miR－193b对参与毛色生成的重要基因MITF和TYR的表达有一定影响，最终选择miR－193b进行研究。通过在绵羊黑色素细胞水平上过表达miR－193b，以探究miR－193b过表达对黑色素细胞中TYR和MITF基因的表达是否有影响以及有何影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 载体的获得及引物合成 真核表达载体为pcDNA6.2－GW/EmGFPmiR（Invitrogen），绵羊黑色素细胞系本实验室保存，引物由北京六合华大科技股份有限公司合成。

1.1.2 试剂 Trizol（Invitrogen，美国）；壮观霉素；转染试剂（Invitrogen，美国）；质粒中提试剂盒（QIAGEN，美国）；SYBR Prime Script TMRT PCR KIT（TAKARA公司）；总蛋白提取试剂盒（碧云天）；MITF（Mouse Monoclonal Antibody，Thermo）；TYR（Rabbit polyclonal antibody，Thermo）；HRP标记的二抗（抗兔，抗鼠，武汉博士德）；蛋白marker（Thermo，美国），ECL高灵敏度化学发光检测试剂盒（北京康为公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 绵羊黑色素细胞的复苏 黑色素细胞系本实验室保存。将冻存的细胞从液氮中取出，迅速放入37℃预热的水浴锅，在1～2min内使冻存细胞完全溶解。4℃1 000r·min－1离心10min，弃上清，用新的黑色素细胞培养基重悬细胞沉淀，将得到的细胞悬液均匀的接种于6孔板的6个孔中，置于37℃，CO2含量为5%的细胞培养箱中培养。第2天更换新鲜培养基继续培养，待细胞铺满细胞板80%左右可进行传代。

1.2.2 黑色素细胞的转染 待6孔板中的黑色素细胞浓度长到75%左右，按照转染试剂盒的说明书进行转染。转染前，配制不含双抗的转染用细胞培养基，经多次试验显示在6孔板3μg的质粒转染效果最好，因此选其为试验浓度。把3μg的DNA加入250μL培养基混匀孵育5min，抽6μL DNA－fectin试剂于250μL培养基中混匀后，把两者混合并孵育20min。移去细胞中的培养基，每孔添加1 mL的不含双抗的培养基，并将含有DNAfectin与DNA复合物的混合培养基均匀接种于6孔板的6个孔，轻轻晃动混匀，置于细胞培养箱培养。培养24h后，用完全培养基终止转染，继续培养36h左右后，收其样品。

1.2.3 细胞黑色素含量测定 移去细胞培养基，用PBS冲洗细胞3次，并进行细胞计数。用0.2 mol·L－1NaOH将细胞在80℃金属浴溶解，将黑色素细胞样品加入酶标板，每个样品3个重复，使用分光光度计在475nm波长进行测值，分析数据，计算黑色素含量变化。

1.2.4 Real－time RT－PCR检测 培养转染细胞72h后，利用Trizol法提取黑色素细胞总RNA，按照反转录试剂盒（TaKaRa公司）的说明书进行cDNA的合成，利用NCBI设计羊MITF和TYR的引物，引物序列见表1。按照荧光定量试剂盒说明书进行Real－time RT－PCR试验，由熔解曲线判定PCR反应的特异性，根据标准曲线以及荧光曲线的CT值计算定量结果，检测MITF和TYR表达量。

△CT（试验组）＝CT（目的基因）－CT（内参基因），△CT（对照组）＝CT（目的基因）－CT（内参基因），△△CT＝△CT（试验组）－△CT（对照组），目的基因的相对表达水平＝2－△△CT。

所有数据用Microsoft Excel进行处理，实时荧光定量PCR结果用“均值±标准差（Means±SD）”表示，其中各基因的表达量结果需经内参基因β－actin表达量的校正，全部数据采用SPSS统计软件进行单因素方差分析检验。

表1 目的基因荧光定量引物序列Table 1 RT－PCR primer sequences of target genes

1.2.5 Western blot检测 按照细胞总蛋白提取试剂盒提取转染细胞总蛋白，测定其浓度后上样，进行SDS－PAGE电泳，再转到NC膜上，将NC膜用5%的脱脂奶粉封闭1h，并用一抗在4℃孵育过夜（MITF和TYR均稀释为1∶500）。第2天早上取出膜，用TBST洗膜10min×3次，放入HRP标记的二抗（1∶2 000）在37℃摇床上孵育1h，再次用TBST洗膜10min×3次。最后用ECL发光试剂盒显色后置于暗室曝光，获得有条带的胶片保存，分析扫描。利用Image－ProPlus 6.0软件对黑色素细胞蛋白MITF、TYR和β－actin免疫印迹结果分析，测定目标条带面积和灰度值，进行半定量分析。数据均用“平均值±标准差（Means±SE）”表示，用SPSS软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1 miR－193b生物信息学分析和筛选

通过Target Scan软件预测，发现基因c－kit和miR－193b存在靶向关系，并结合前人研究，提示miR－193b通过调控c－kit基因参与毛色调控。经典的白色基因座编码的c－kit受体属于酪氨酸激酶受体家族成员［12］。Kit基因编码肥大干细胞生长因子受体与黑色素的生物合成密切相关［13］，对黑色素细胞的形成、成熟及增殖迁移有重要作用。

2.2 黑色素细胞的生长状态观察

正常细胞接种12h后，即可见黑色素细胞贴壁伸展，第2天细胞密度增大，生长状态良好，无细胞污染，细胞形态呈现长梭形（图1）。

2.3 miR－193b在黑色素细胞的转染

2.3.1 黑色素细胞的转染效果观察 试验分黑色素细胞阴性对照组（Negative Control，NC组）和转染miR－193b真核表达载体组（试验组），在细胞密度达到75%即可进行转染，将miR－193b真核表达载体转染入黑色素细胞56～72h，由于载体上连接了1个启动报告基因绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP），转染后的细胞在荧光显微镜蓝光的激发下可看到细胞呈绿色荧光，可以观察到转染成功的细胞生长良好，细胞形态单一，而且转染效率较好，未见其他细胞污染（图2）。

图1 正常的黑色素细胞Fig.1 Normal melanocytes

图2 miR－193b转染黑色素细胞的效率Fig.2 The efficiency of transfecting melanocytes by miR－193b

2.3.2 转染后黑色素含量测定 收集转染后的试验组和NC组细胞，分别进行细胞计数，并用分光光度计测定475nm处吸光值，分析统计试验组和NC组的黑色素相对含量，结果显示，转染miR－193b真核表达载体的黑色素细胞的黑色素含量明显降低（图3）。

图3 转染miR－193b和NC后黑色素细胞中黑色素含量Fig.3 Melanin content in melanocytes transfected withmiR－193band negative control

2.3.3 Real－time RT－PCR检测miR－193b，MITF 和TYR在mRNA水平的表达量 转染后，分别提取试验组和NC组的总RNA，反转录为cDNA，分别对miR－193b、MITF和TYR进行Real－time RT－PCR检测，结果显示：转染miR－193b后，miR－193b的表达量明显上调为NC组的10.01倍，MITF基因的mRNA表达量显著降低为NC组的0.233倍，TYR基因的mRNA表达量显著降低为NC组的0.198倍（图4）。结果表明：在黑色素细胞中过表达miR－193b会使基因MITF和TYR的mRNA表达量降低且差异均极显著（P＜0.01），从而说明过表达miR－193b会影响黑色素生成。

2.3.4 Western blot检测MITF和TYR蛋白表达量 转染后分别提取试验组和NC组的总蛋白，按500ng上样量进行电泳，转膜，孵育抗体，曝光，扫描分析后的蛋白条带用ImageJ软件分析，结果显示：与NC组相比，MITF和TYR的蛋白表达量均显著降低，MITF降低为0.232倍，TYR降低为0.321倍（图5）。结果表明：在黑色素细胞中过表达miR－193b会使基因MITF和TYR的蛋白表达量降低，且差异均极显著（P＜0.01），从而说明过表达miR－193b会影响黑色素生成。

图4 转染miR－193b和NC的黑色素细胞中miR－193b、MITF和TYR在mRNA表达水平检测Fig.4 Expression analysis of miR－193b，MITF，TYRin melanocytes transfected with miR－193band negative control

图5 转染miR－193b和NC的黑色素细胞中MITF和TYR在蛋白水平检测Fig.5 Western blotting analysis of MITF，TYR in melanocytes transfected with miR－193band negative control

3 讨 论

本试验利用细胞转染技术，将miR－193b转染入黑色素细胞，以及miR－193b在黑色素细胞中对黑色素的生成的影响进行研究。通过对黑色素细胞中黑色素含量进行提取测定，同时经qRT－PCR方法对黑色素细胞中的miR－193b、MITF和TYR在mRNA水平进行检测，经Western bolt方法对黑色素细胞中的MITF和TYR在蛋白水平检测，结果显示：过表达miR－193b使MITF和TYR在转录水平和翻译水平上都显著降低，通过影响MITF和TYR这两个在黑色素生成路径上有重要作用的基因的表达，从而降低黑色素细胞合成黑色素的含量。这个结果提示，miR－193b很可能影响动物毛色表型的变化并对毛色进行调控。

miR－193b在众多癌症的发生过程中均有抑制作用，如郑颖［14］发现miR－193b是宫颈癌细胞的一个肿瘤抑制因子，通过下调Mcl－1来发挥抑制作用；有研究表明，不同毛色羊驼皮肤miR－193b可能通过调控靶基因Kit来参与毛色形成；而Kit基因编码肥大干细胞生长因子受体（mast/stem cell growth factor receptor，c－kit）在特定的细胞中表达，对黑色素细胞的形成、成熟及增殖迁移有重要作用。哺乳动物的显性白毛色、小鼠的显性白点（W）突变和人的花斑性状（PBT）均由Kit位点调控［15－16］。同源的Kit基因突变在猪及禽类都表现为显性的白色斑点。

黑色素的生成是一个复杂的多因素共同调控的生理机制，其中有众多相关的调控基因，而Kit基因是与黑色素细胞生成环节相关的基因之一。目前研究得比较清楚的调节黑色素细胞增殖分化的信号转导途径之一有MAPK级联途径［17］，其中c－kit配体为“青灰细胞生长因子（Steel cell growth factor，SCF），两者结合后通过Ras蛋白作用进入Raf－MEK－ERK途径，进而对小眼畸形相关转录因子（Microph－thalamia－associated transcription factor，MITF）进行调控，MITF通过与酪氨酸酶启动子区域结合而调控TYR以及酪氨酸相关蛋白的表达［18］。黑色素的形成是由酪氨酸和苯丙氨酸经过一系列氨化酶的催化作用而成的，其中的酪氨酸酶（TYR）是催化酪氨酸进一步反应的氧化酶。由此可见基因MITF和TYR是黑色素生成过程中至关重要的两个关键基因，而miR－193b的靶基因Kit一定程度上调控下游基因MITF 和TYR的表达量。

4 结 论

通过在黑色素细胞中过表达miR－193b，发现过表达miR－193b可以使黑色素合成路径上有重要作用的基因MITF和TYR的mRNA和蛋白表达量均降低，结果表明，miR－193b影响黑色素细胞生成黑色素。

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（编辑 程金华）

The Influences of Over－Expressing miR－193bon MITF and TYR in Melanocytes

ZHANG Ya－ling1，XU Dong－mei2，DU Bin1，XIE Jian－shan1，FAN Rui－wen1，YU Xiu－ju1，ZHU Zhi－wei2，DONG Chang－sheng1*
（1.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China；2.College of Life Science，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

Abstract：MITF and TYR have been identified to be crucial in the process of melanogenesis，the study aims to investigate the relationship between MITF，TYR and miR－193b，and then to determine the functional roles of miR－193bin the regulation of melanogenesis in melanocyte.The melanocytes were transfected with the miR－193bplasmid，tested the assay of melanin，and analyzed expression patterns of MITF and TYR using real－time PCR and Western blotting.The results indicated that over－expression of miR－193bin melanocyes reduced the assay of melanin and decreased the expression of MITF and TYR both at the mRNA and protein level，the level of MITFmRNA and TYRmRNA were reduced to 0.233times（P＜0.01）and 0.198times（P＜0.01）respectively，the level of MITF and TYR proteins were reduced to 0.232times and 0.321times which was significantly different.Results support the role of miR－193bin melanocytes indirectly，which regulated the melanogenesis by MITF and TYR.

Key words：miR－193b；MITF；TYR；melanocytes

中图分类号：S829.9

文献标志码：A

文章编号：0366－6964（2016）05－0938－06

doi：10.11843/j.issn.0366－6964.2016.05.010

收稿日期：2015－11－09

基金项目：国家“863”计划（2013AA102506）；公益性行业（农业）科研专项（201303119）；农业部“948”项目（2011－Z33）；山西省青年基金（2014021028－2）

作者简介：张亚玲（1990－），女，山西运城人，硕士生，主要从事羊驼生物工程研究，E－mail：zyaling＿0601@163.com

*通信作者：董常生，教授，博士生导师，E－mail：cs＿dong@sxau.edu.cn