HGF-cMet拮抗剂NK4增强肝癌细胞Li-7对5-FU的敏感性

姜蓬垒 张 栋 李美宁 常冰梅（山西医科大学生物化学与分子生物学教研室，山西 太原 030001）



HGF-cMet拮抗剂NK4增强肝癌细胞Li-7对5-FU的敏感性

姜蓬垒 张 栋 李美宁 常冰梅*
（山西医科大学生物化学与分子生物学教研室，山西 太原 030001）

【摘要】目的 探索肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor，HGF）对肝癌细胞Li-7增殖及对化疗药物5-FU耐受的影响；研究利用HGF拮抗剂-NK4增强Li-7细胞在HGF存在的情况下对5-FU的敏感性的影响。方法 将前期构建的真核细胞表达质粒pcDNA3.1-NK4、pcDNA3.1分别转染至Li-7细胞中。MTT法检测不同浓度（0、0.2、2、20 ng/mL）HGF对Li-7细胞增殖的影响；确证HGF是否会诱导Li-7对5-FU产生耐受；检测在HGF、5-FU的干预下，未转染组、转染pcDNA3.1组、转染pcDNA3.1-NK4组的Li-7细胞生存率的差异。结果 在HGF的刺激下，Li-7的存活率没有明显变化（P＞0.05）。但HGF（20 ng/mL）、5-FU（50 μg/mL）共同处理与5-FU单独处理相比，细胞存活率明显提升（P＜0.01）。在HGF（20 ng/mL）与不同浓度的5-FU（0、5、50、500 μg/mL）的干预下，转染pcDNA3.1-NK4组与转染pcDNA3.1组的Li-7细胞相比细胞生存率都明显降低（P＜0.05）。结论 HGF可以诱导Li-7产生耐药性，而NK4能够减弱HGF 对Li-7细胞的刺激，增强5-FU对Li-7的增殖抑制作用。

【关键词】肝细胞生长因子；NK4；5-FU；药物耐受

HGF参与了多种肿瘤的发生、发展和转移［1］。c-MET作为HGF的细胞膜表面受体，在HGF的作用下磷酸化激活，而后活化的c-MET再激活其下游多条关键的信号通路，产生促进肿瘤细胞增殖、转移及抗凋亡的生物学效应［1-2］。NK4是包含了HGF N-末端的发卡结构域和后面的4个环状结构域的HGF片段，它可以竞争性的抑制HGF对细胞的刺激［3］。HGF的过表达常导致肿瘤产生药物耐受［1］，因此将NK4和化疗药物联合起来抑制肿瘤生长似乎成为了一个较为理想的手段。本文首先探索HGF对Li-7增殖、耐药的影响，然后再尝试利用NK4增强Li-7细胞在HGF存在的情况下对5-FU的敏感性。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株以及细胞株：pcDNA3.1-NK4质粒、pcDNA3.1质粒、大肠杆菌DH5α、肝癌细胞株Li-7由本室构建或保存。

1.2 主要试剂：HGF购自PeproTech公司；5-FU；胰蛋白胨、琼脂、酵母粉购自OXOID公司；NaCl购自天津市风船化学试剂科技有限公司；PBS购自北京索莱宝科技有限公司；Endo Free Plasmid Mini KitⅠ购自OMEGA公司；1640培养液购自Hyclone公司；氨苄青霉素、青霉素链霉素混合液购自北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司；胰蛋白酶购自AMERSCO公司；DMSO、MTT购自AMERSCO公司；Lip2000、Annexin V-FITC/PI双染流式检测试剂盒购自Invitrogen公司。

1.3 质粒提取：将携带有pCDNA3.1/NK4和pCDNA3.1质粒的DH5α菌种接种于LB/氨苄青霉素液体培养基中，37 ℃摇床培养12～16 h。按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒。

1.4 细胞转染：取对数生长期的Li-7细胞接种在6孔板中，待汇合度达到50%～60%时弃去培养液，PBS清洗两遍，加入预热至37 ℃无血清、抗生素的1640完全培养液。按照Lip2000说明书进行转染，6 h后更换为含10%FBS的1640完全培养液。24 h后进行后续实验。

1.5 MTT法检测细胞存活率：选取处于对数生长期或者转染后的Li-7细胞，消化后制成单细胞悬液，按照1×104个/孔接种至96孔板中。24 h后更换为含有药物、10%的胎牛血清的1640完全培养液，在37 ℃、5%CO2，饱和湿度的条件下培养48 h。每孔加入MTT溶液20 μL，继续在培养箱中孵育3 h。小心吸取培养基，每孔加入150 μL的DMSO，在摇床上震荡约20 min。选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上检测各孔吸光值。每组5个平行孔，实验重复3次。根据下面的公式计算各实验组的存活率：存活率=（实验组OD-空白组OD）/（对照组OD-空白组OD）1.6 统计学分析：实验结果均以表示，统计分析采用one way ANOVA。用SPSS17.0进行统计分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HGF对Li-7增殖的影响：见图1。以不同浓度（0、0.2、2、20 ng/mL）的HGF刺激Li-7细胞48 h后，用MTT法检测HGF对细胞增殖能力的影响。如图1所示，各浓度的HGF对Li-7细胞的增殖能力影响不大，当HGF浓度为20 ng/mL时，细胞的存活率也只有104.9%±3.2%，与对照相比差异不具有统计学意义（P＞0.05）。

图1 HGF对Li-7增殖能力的影响

2.2 HGF诱导Li-7对5-FU产生耐受：见图2。当HGF浓度为0.2 ng/mL或2 ng/mL时，HGF与5-FU（50 μg/mL）共同处理组的细胞存活率与单加5-FU组的细胞存活率相比，差异不具有统计学意义（P＞0.05）；当HGF浓度达到20 ng/mL时，共同处理组与单加5-FU组相比，细胞存活率提高了15.8%，差异具有统计学意义（P＜0.01）。即此时Li-7表现出较高的药物耐受。选择20 ng/mL的HGF浓度进行后续实验。

图2 HGF诱导Li-7对5-FU产生耐受

2.3 NK4逆转HGF导致的化疗耐受：见图3。不同浓度的5-FU处理后，转染有NK4基因的细胞与转染有空载质粒的细胞相比，转染有NK4基因的细胞的存活率均有不同程度的下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图3 NK4抑制HGF诱导的药物耐受

3 讨 论

HGF对于多数类型的肿瘤细胞来说都具有促增殖、侵袭、迁移的作用，但是它对于很多肝癌细胞来说，它又具有了双重作用：一方面，HGF促进了肝癌细胞HepG2、Huh7等细胞的运动性；另一方面，HGF又抑制了这些细胞的增殖［4］。本研究发现，HGF对Li-7细胞的增殖无明显影响。这表明多功能的细胞因子HGF对于不同的肝癌细胞株表现出不同的生物学效应。

HGF/c-MET信号通路具有促增殖、抗凋亡的作用，从而使细胞受到化疗药物的伤害减少，导致了耐药性的产生［1］。已经有大量的研究表明HGF能够诱导多种类型的肿瘤细胞产生耐药性，但是目前仅有关于HGF可以引起肝癌细胞HEP3B产生耐药性的报道［5］。通过细胞增殖实验，我们发现低浓度的HGF并没有影响Li-7细胞对5-FU的敏感性，但是将HGF的浓度提高到20 ng/mL之后，细胞的存活率明显提高，这说明高浓度的HGF可以诱导Li-7耐药性的产生。

在以前的研究中，NK4只是被用来抑制HGF诱导的肝癌细胞侵袭、迁移等［6］，因此在发现HGF可以诱导肝癌细胞Li-7耐药之后，我们也尝试利用NK4逆转肝癌细胞耐药。细胞增殖结果显示，在HGF与5-FU的共同作用下，转染有NK4基因的Li-7细胞存活率与转染有空载质粒的Li-7细胞存活率相比明显降低。这说明NK4有效的减弱了HGF对细胞的保护作用，增强了Li-7对5-FU的敏感性。

本研究发现HGF可以诱导Li-7细胞产生对5-FU的耐药性，而利用NK4可以减弱HGF对Li-7细胞促生存、抗凋亡的作用，逆转耐药性。这提示有望利用NK4基因针对肝癌患者进行基因靶向治疗，为肝癌治疗提供新策略和新方法。

参考文献

［1］ Jiang WG，Martin TA，Parr C，et al.Hepatocyte growth factor，its receptor，and their potential value in cancer therapies［J］.Crit Rev Oncol Hematol，2005，53（1）:35-69.

［2］ You H，Ding W，Dang H，et al.c-Met represents a potential therapeutic target for personalized treatment in hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，2011，54（3）:879-89.

［3］ Datea K，Shimurab H，Tanakab M，et al.HGF/NK4 is a specific antagonist for pleiotrophic actions of hepatocyte growth factor［J］. FEBS Lett，1997，420（1）:1-6.

［4］ Giordano S，Columbano A.Met as a therapeutic target in HCC: facts and hopes［J］.J Hepatol，2014，60（2）:442-52.

［5］ Yu G，Jing Y，Kou X，et al.Hepatic stellate cells secreted hepatocyte growth factor contributes to the chemoresistance of hepatocellular carcinoma［J］.PloS One，2013，8（9）:e73312.

［6］ Heideman DA，Overmeer RM，van Beusechem VW，et al.Inhibition of angiogenesis and HGF-cMET-elicited malignant processes in human hepatocellular carcinoma cells using adenoviral vector-mediated NK4 gene therapy［J］.Cancer Gene Ther，2005，12（12）:954-962.

中图分类号：R735.7

文献标识码：B

文章编号：1671-8194（2016）10-0043-02

*通讯作者：E-mail：cbmcn@163.com