BMP9 转染脂肪干细胞联合纳米相羟基磷灰石联合修复下颌骨

何锦泉丁江峰欧阳可雄黄 珞陈伦秋朴正国（ 广州医科大学附属口腔医院•广州口腔病研究所•口腔医学重点实验室，广东 广州 5040； 广东医学院附属南山医院口腔科，广东 湛江 54000）



BMP9 转染脂肪干细胞联合纳米相羟基磷灰石联合修复下颌骨

何锦泉1丁江峰2欧阳可雄1黄 珞1陈伦秋1朴正国1
（1 广州医科大学附属口腔医院•广州口腔病研究所•口腔医学重点实验室，广东 广州 510140；2 广东医学院附属南山医院口腔科，广东 湛江 524000）

【摘要】目的 评价应用BMP-9基因修饰的ADSCs作为种子细胞，以纳米羟基磷灰石作为载体，构建组织工程化骨来修复大鼠下颌骨骨缺损的效果。方法 通过腺病毒转染的方法把BMP9介导到大鼠脂肪干细胞，使细胞均匀分布于纳米羟基磷灰石上。用牙科裂钻在下颌角区制备3 mm ×3 mm的骨缺损区，分别植入纳米羟基磷灰石及BMP9-ADSCs。于术后3个月处死动物，行microCT扫描及组织学检查，评价骨缺损的修复情况。结果 实验组A见大量新生骨，可见成熟骨细胞。实验组B较多新生骨形成，骨细胞接近成熟。对照组骨缺损处基本被纤维组织充填，未见新骨生成。结论 纳米羟基磷灰石与BMP9转染的大鼠脂肪干细胞复合物植入下颌骨缺损中，可以促进骨缺损修复，增加血管化与骨化。

【关键词】BMP9；脂肪干细胞；纳米羟基磷灰石；骨缺损

长期以来，颌骨修复一直是口腔颌面外科领域的热点和难点。用羟基磷灰石衍生物作为组织工程载体的研究已取得初步结果。本实验通过腺病毒将人骨形态发生蛋白-9（ human bone morphogenetic protein，hBMP-9）体外转染大鼠脂肪干细胞（adipose derived stem cells，ADSCs），应用BMP-9基因修饰的ADSCs作为种子细胞，以纳米羟基磷灰石作为载体，构建组织工程化骨来修复大鼠下颌骨骨缺损。

1 材料与方法

1.1 重组BMP9腺病毒的构建、鉴定：采用Adeno-XTM 试剂盒构建重组携带BMP9基因的腺病毒，通过脂质体载体介导转染293细胞，获得携带BMP9基因的腺病毒液，再通过293细胞大量扩增携带BMP9的腺病毒液，光比色法测定滴度，超离纯化后，浓缩得到1010～1011 pfu/uL的BMP9腺病毒液。

1.2 大鼠脂肪干细胞的获取及基因转染：选取SD大鼠10只，从双侧腹股沟内获取脂肪组织，用剪刀剪碎后加入I型胶原酶（浓度1 mg/mL）消化，37 ℃在振荡器上摇晃1 h，然后以1000 rpm离心5 min，获得的细胞用DMEM培养液（含10%FBS）制成均匀的细胞悬液，均匀接种于培养皿中，在CO2孵箱中培养，温度为37 ℃，每3～4 d换液1次。采用第5代

ADSCs作为种子细胞，用流式细胞仪检测ADSCs相对特异细胞表面标志CD29、CD90及CD45，每个培养皿中加入3 mL携带hBMP-9 基因的重组腺病毒液，37 ℃过夜，获得BMP9转染的ADSC，用于实验。

1.3 BMP9-ADSC与纳米羟基磷灰石的复合：收获BMP9-ADSC制备细胞悬液，采用反复滴加的方法，使细胞均匀分布于纳米羟基磷灰石上。

1.4 模型建立：大鼠下颌骨缺损模型制备：对12只SD大鼠用10%水合氯醛行全身麻醉，在右侧下颌骨下缘近下颌角处作约1 cm的切口，分离暴露下颌骨，在下颌角区用牙科裂钻制备3 mm×3 mm的骨缺损区，造模后即刻在缺损区植入纳米羟基磷灰石材料（实验组A）或者脂肪干细胞与纳米羟基磷灰石的复合材料（实验组B），左侧缺损区作为对照组，仅制备骨缺损区，未植入任何材料。

1.5 标本处理及检测指标：于术后3个月处死动物，行microCT扫描，根据三维重建的结果来评价骨缺损的修复情况。然后标本置于10%的福尔马林溶液，固定24 h后，用20%甲酸溶液中进行脱钙，制成石蜡标本，行苏木精-伊红染色。主要观察指标：大鼠体内植入材料降解情况和组织学检测结果，对标本行HE染色，观察新生骨小梁的生长与改建情况。

2 结 果

2.1 组织学检查：实验组A见大量新生骨，可见成熟骨细胞。实验组B较多新生骨形成，骨细胞接近成熟。对照组骨缺损处基本被纤维组织充填，未见新骨生成（图1）。

2.2 影像学观察：实验组A材料与骨组织融合在一起，修复良好，塑型基本完成，原缺损空腔几乎完全长满新生骨组织；实验组B缺损边缘基本连续，材料与骨接触紧密，有较多新生骨形成且密度较高，缺损边界模糊；对照组缺损处密度明显低于正常骨组织，边界非常清晰，修复效果较差（图2）。

图1 各组骨缺损区组织学改变（苏木精-伊红染色，×100）

图2 各组骨缺损区microCT三维重建影像

3 讨 论

目前临床上治疗肿瘤引起的下颌骨是颌面外科常见的一个难题，用羟基磷灰石衍生物作为组织工程载体的研究已取得初步结果。谢红军等［1］将纳米羟基磷灰石与骨髓基质细胞复合培养后回植于兔股骨缺损区，结果证实纳米羟基磷灰石对细胞具有黏附性，适合细胞爬行替代，降低同种异体骨的用量，减轻机体的免疫反应，可以作为外源生长因子的良好载体。谭羽莹等［2］发现羟基磷灰石的生物活性与其颗粒大小有关，颗粒越小，新生骨的拉伸强度、拉伸模量和扭转模量就越高，抗疲劳性也相应提高，因此纳米羟基磷灰石将更有利于提高植入物力学性能，克服其抗折强度低、脆性大、不能承重的缺点。

在以往的研究中，骨组织工程的种子细胞基本来源于骨髓，但因其取材受到限制，给患者带来极大痛苦而限制其临床应用［3］。与骨髓干细胞相比，ADSCs具有取材方便，来源充足的特点［4］。本研究结果显示，BMP9-ADSC联合纳米羟基磷灰石组的骨缺损区的修复效果最明显，原缺损区几乎全部被新生骨组织充满。对照组与实验组比较表明，骨缺损周边三个创面虽然观察到修复表现，但骨缺损区主要被肉芽组织充填，说明BMP9-ADSCs与支架材料间良好的黏附作用及ADSCs在支架材料上正常增殖、分化，发挥成骨活性的作用，表明加入BMP9-ADSCs的修复材料更有利于骨缺损的修复。贺金晓等［5］通过在兔身上构建假体周围骨缺损模型，通过慢病毒介导骨形态发生蛋白2和转化生长因子B3双基因转染兔骨髓基质干细胞（MSCs），与羟基磷灰石复合，然后植入白兔骨缺损内，观察其对假体-骨界面的影响。结果显示骨结合强度及假体骨界面骨接触率随着时间的延长而增大，术后12周与8周比较，有显著性差异。作者认为，纳米羟基磷灰石及其复合物能够促进骨的再生，加速骨修复的进程，具有很好的临床应用前景。

本研究结果显示，纳米羟基磷灰石与BMP9转染的大鼠脂肪干细胞复合物植入下颌骨缺损中，可以促进骨缺损修复，增加血管化与骨化，是骨组织工程中一种效果明显，值得推广的复合物。

参考文献

［1］ 谢红军，王银龙，周健，等.纳米羟基磷灰石复合骨髓基质细胞修复兔股骨缺损的实验研究［J］.口腔医学，2008（3）:154-156.

［2］ 谭羽莹，邵英，李玉新，等.改性纳米羟基磷灰石/聚乳酸-聚羟乙酸复合骨髓基质干细胞修复兔桡骨缺损［J］.中国组织工程研究，2012，16（21）:3843-3846.

［3］ 吴子征，李受珉，王泽，等.同种异体脂肪源性间充质干细胞复合β-磷酸三钙支架修复兔桡骨大段骨缺损［J］.复旦学报:医学版，2015，42（3）:338-343.

［4］ 沈凌，王锡友，陈萍，等.同种异体脂肪干细胞复合纳米级胶原基骨材料修复尺骨缺损［J］. 中国组织工程研究，2015，19（32）:5162-5166.

［5］ 贺金晓，王英振，夏长所，等.双基因转染兔骨髓基质干细胞与胶原/羟基磷灰石复合修复骨缺损及对假体-骨界面整合的影响［J］.中华临床医师杂志（电子版），2013，7（6）:128-132.

中图分类号：R318.08

文献标识码：B

文章编号：1671-8194（2016）10-0042-02

基金项目：广州市医药卫生资助项目（20141A011098）