保存条件对提取全血基因组DNA质量的影响

吕晓岩 杨志岗（中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院研究中心，北京 100144）



保存条件对提取全血基因组DNA质量的影响

吕晓岩 杨志岗
（中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院研究中心，北京 100144）

【摘要】目的 比较从新鲜和冻存全血中提取基因组DNA的效果。方法 分别取300 μL抗凝新鲜和-75 ℃冻存3个月的血样，用全血基因组DNA提取试剂盒抽提基因组DNA，通过紫外分光光度计、电泳、PCR进行检测。结果 抗凝新鲜和冻存血样提取的基因组DNA总量分为：（16.62±12.12）μg和（7.94±4.18）μg；纯度分别为（1.85±0.01）和（1.84±0.02）。结论 新鲜血样提取的基因组DNA总量要高于冻存血样差异显著，纯度无显著差别，低温冷冻保存使提取全血基因组DNA的产量降低。

【关键词】全血；基因组DNA；外周血

目前医学上很多疾病的研究发展到了基因水平上。而对于基因水平的研究首先就是要从患者或对照的外周血中提取基因组DNA［1］。然而采集大量标本时往往很难在短时间内立即提取DNA，这种情况下就会涉及到标本的保存。本实验将同一抗凝全血分成新鲜组和冻存组，并对两组提取基因组DNA的总量和纯度进行比较，探讨低温冷冻条件对全血DNA提取效率的影响。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂：NanoDrop 2000c超微量紫外分光光度计（美国），UVP凝胶成像系统（美国），高速离心机（日本），PCR仪（德国），漩涡混合器（国产）；promega公司全血基因组DNA提取试剂盒。

1.2 方法

1.2.1 样品：人外周血10份，枸橼酸钠抗凝，2000 r/min离心10 min，分离血浆和血细胞。血细胞分成两份每份300 μL/份，一份立即提取，一份-75 ℃冻存2个月后提取。

1.2.2 DNA提取：①将300 μL抗凝血置于1.5 mL离心管中，加900 μL Cell Lysis Solution，混合，上下颠倒数次，室温静置10分钟，13000-16000 ×g/min离心20 s，弃上清。②沉淀中加300μL Nuclei lysis Solution充分震荡裂解成悬液，再加入100μL Protein Precipitation Solution 漩涡震荡20 s，（13000～16000）×g/min离心3 min，吸取上清转移到一个干净1.5 mL离心管中，加300 μL异丙醇沉淀DNA。③100 μL 70%乙醇洗涤沉淀，（13000～16000）×g/min离心1 min，两次，弃上清，待干，TE溶解DNA。

1.2.3 DNA含量和纯度检测：各取2 μL两组提取的基因组DNA样本，紫外分光光度计测定基因组DNA的含量及A260/A280的比值［2］。

1.2.4 体外PCR扩增：用管家基因GAPDH进行扩增。上游引物：5’-GCACCGTCAAGGCTG

AGAAC-3’，下游引物：5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’，反应体系20 μL，DNA含量200 ng；反应条件：94 ℃预变性1 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环。

1.2.5 统计学分析：应用SPSS 16.0软件进行统计学分析，组间比较t检验，结果以均值±标准差表示，P＜0.05有统计学意义。

2 结 果

2.1 基因组DNA总量和纯度比较结果：见表1。

表1 两组提取的基因组DNA各项指标比较（n=10）

对两组血样标本提取的DNA总量和纯度进行比较，经统计学分析，新鲜组提取的DNA总量高于冻存组有统计学意义P＜0.05；两组提取的DNA纯度差异无统计学意义P＞0.05。

2.2 PCR产物琼脂糖凝胶电泳：两组DNA扩增内参基因GAPDH，1%琼脂糖凝胶电泳，电压100 V，40 min，用凝胶成像系统观察结果，两组均可见与预期大小一致的目的条带，可以达到分子生物学试验的要求。见图1～2。

3 讨 论

一些疾病可以通过对DNA的分析进行诊断，从全血中提取基因组DNA是多种分子生物学实验的第一步［3］。基因组DNA的产量取决于白细胞的数量。血液中只有白细胞含有DNA，是基因组DNA提取的常用实验材料，而白细胞数成人正常值在（4～10）×109/L，相对一些小儿患者血液中的DNA量会比较少。因此如何快速、经济的获得高品质的基因组DNA具有十分重要的意义。影响DNA产量和纯度的原因有很多，不同的提取方法提取的基因组DNA产量和纯度有所不同，如酚氯仿法、异硫氰酸胍法、固相吸附法、盐析法和碘化物法等［4-6］。

通过本实验的研究，从冷冻保存的抗凝血中提取的DNA总量少于新鲜血样，可能与从冻存标本中去除红血素需要的清洗步骤较多有关［7］。冻存的血样提取过程首先要化冻，反复冻融某种程度上会使提取基因组DNA的数量有所损失。获得高质量DNA的关键之一是防止DNA降解，冻存时间越长DNA产量会越低，可见标本的保存条件对于保证DNA的提取质量至关重要。今后工作中，重要临床标本尽量用新鲜的血样提取基因组DNA，避免冻融减少标本DNA数量的损失。

图1 新鲜血样组PCR电泳图

图2 冻存血样组PCR电泳图

参考文献

［1］ 白春英，周静，瑞云，等.经济、有效提取外周血基因组DNA的方法［J］.检验医学与临床，2010，9（7）:1795.

［2］ 田子强，刘俊峰，张少为，等.甲醛固定石蜡包埋组织中DNA的三种提取方法比较［J］.基础医学与临床，2004，4（4）:335-338.

［3］ 胡盛平，朴英姬，陈玲，等.三种全血提取基因组DNA的方法的比较Genomix方法的改良［J］.汕头大学医学报，2001，14（4）:263-265.

［4］ 张帅，徐锐，张强，等.改良盐析法提取全血基因组DNA的影响因素研究［J］.中国现代医学杂志，2012，22（35）:42-46.

［5］ 杨泽民，罗少洪，陈耕夫.三种全血基因组DNA提取方法的比较［J］.中国实用医药，2009，4（12）:13-14.

［6］ 贾二娟，朱伟锋，余乐涵.蛋白酶K对盐析法提取全血DNA的影响［J］.实验与检验医学，2011，29（3）:263 -264.

［7］ 焦鹏，叶文静，常起，等.人血细胞DNA无酚提取法［J］.基础医学与临床，2007，27（8）:918.

中图分类号：R34

文献标识码：B

文章编号：1671-8194（2016）10-0028-02

Effect of Preservation Conditions on the Quality of Whole Blood Genomic DNA

LV Xiao-yan， YANG Zhi-gang
（Research Center of Plastic Surgery Hospital， Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College， Beijing 100144， China）

［Abstract］Objective To compare the quality of genomic DNA extracted from fresh and frozen whole blood. Methods 300 μL fresh whole blood samples were applied to extract the genomic DNA using whole blood genomic DNA Extraction Kit. The samples also were frozen at -75 ℃ for three months， and then the genomic DNA was extracted by the same method. UV spectrophotometer， electrophoresis and PCR were used to detect the purity and quantity. Results The total genomic DNA extracted from fresh and frozen blood samples were （16.2±12.12）μg and （7.94±4.18）μg， respectively， the A260/A280 purity was: （1.85±0.01） and （1.84±0.02）. Conclusion The total genomic DNA extracted from fresh blood samples was significantly more than that from frozen blood samples， while the purity was observed with no significant difference between the two groups. In this way， low temperature freezing could decrease the yield of genomic DNA from whole blood cells.

［Key words］Whole blood； Genomic DNA； Peripheral blood