新疆维、汉族宫颈鳞癌病变与PI3K、ERK、IGF-1R、ER蛋白表达的关系*

杜　靖，荣小灵，宁　超，沙　静

(1.新疆医科大学高职学院机能教研室，乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学第二附属医院检验科，乌鲁木齐 830064；3.新疆医科大学研究生学院，乌鲁木齐 830011；4.新疆生产建设兵团医院妇产科，乌鲁木齐 830002)



新疆维、汉族宫颈鳞癌病变与PI3K、ERK、IGF-1R、ER蛋白表达的关系*

杜靖1，荣小灵2，宁超3，沙静4△

(1.新疆医科大学高职学院机能教研室，乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学第二附属医院检验科，乌鲁木齐 830064；3.新疆医科大学研究生学院，乌鲁木齐 830011；4.新疆生产建设兵团医院妇产科，乌鲁木齐 830002)

[摘要]目的从蛋白质水平观察子宫颈炎和子宫颈鳞癌组织中磷酸肌醇3激酶(PI3K)、细胞外信号调节激酶(ERK)、胰岛素样生长因子-1型受体(IGF-1R)和雌激素受体(ER)在新疆维吾尔族和汉族妇女中的表达及相关关系。方法收集石蜡包埋宫颈炎组织90份(汉族46份，维吾尔族44份)、子宫颈鳞癌组织224份(汉族36份，维吾尔族188份)，采用免疫组织化学SP法鉴定蛋白表达水平。结果子宫颈鳞癌IGF-1R、PI3K阳性表达率(58.04%、92.41%)高于宫颈炎组织(13.33%、57.78%)，ER、ERK阳性表达率(22.32%、68.30%)低于宫颈炎组织(63.33%、95.56%)；汉族、维吾尔族子宫颈鳞癌IGF-1R和PI3K阳性表达率(69.44%和88.89%，55.85%和93.09%)高于宫颈炎组织(15.22%和54.35%，11.36%和61.36%)；汉族、维吾尔族子宫颈鳞癌ER和ERK阳性表达率(13.89%和83.33%，23.94%和65.43%)低于宫颈炎组织(65.22%和93.48%，61.36%和97.73%)；ERK在维吾尔族子宫颈鳞癌组织中表达(65.43%)低于汉族(83.33%)，差异均有统计学意义(P<0.01)。结论PI3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白表达阳性或缺失与宫颈癌发生关系密切，可作为宫颈癌检测的重要生物指标，ERK蛋白在宫颈癌中的表达存在民族间差异。

[关键词]宫颈肿瘤；磷酸肌醇3激酶；细胞外信号调节激酶；受体，IGF 1型；受体，雌激素

宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，发病率逐年增高，而且逐渐趋于年轻化，因此，有关宫颈癌的预防、治疗等相关研究近年来已引起学术界的广泛关注。宫颈癌发生、发展是多种影响因素互相协同作用的结果，胰岛素样生长因子-1型受体(insulin-like growth factor receptor，IGF-1R)在宫颈癌中过度表达而导致预后不良[1]，并受雌激素受体(estrogen receptor，ER)调节，二者通过共同抑制IGF-1细胞增殖作用的磷酸肌醇3激酶(phosphoinositide 3 kinase，PI3K)、细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)与肿瘤关联[2]。新疆维吾尔族妇女宫颈癌患病率及病死率均明显高于本地汉族、哈萨克族、蒙古族，病死率是新疆其他民族平均水平的3～4倍，在全国少数民族中占第1位。目前，关于子宫颈鳞癌组织中PI3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白在维吾尔族与汉族之间表达的相关文献在国内外的研究尚少见报道，本研究采用免疫组织化学法检测PI3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白在维吾尔族与汉族子宫颈不同病变中的表达情况，探究各因素与宫颈癌发生、发展的关系。

1资料与方法

1.1一般资料收集新疆医科大学第一附属医院及和田地区人民医院石蜡包埋的宫颈炎组织90份(汉族46份，维吾尔族44份)，子宫颈鳞癌组织224份(汉族36份，维吾尔族188份)。所有标本经病理检查确诊。免疫组化试剂兔抗人多克隆抗体PI3K购自北京中杉金桥公司(1∶150)，ER购自福建万森生物科技有限公司(1∶100)，ERK(1∶50)、IGF-1R(1∶500)购自美国SANTA公司。二抗、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自北京中杉金桥公司。

1.2方法

1.2.1免疫组化S-P法检测石蜡切片常规脱蜡水化，并在0.01 mmol/L柠檬酸抗原修复液中通过微波修复法预处理；置于0.3% H2O2孵育10 min，阻断内源性过氧化物酶活性。滴加试剂A(含10%山羊血清)于组织切片上(需完全覆盖待检组织)，室温孵育10 min，加入一抗，4 ℃培养过夜，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗5 min，共3次。滴加试剂B室温孵育10 min，PBS冲洗5 min，共3次；滴加试剂C室温孵育10 min，PBS冲洗5 min，共3次。滴加新鲜配制的DAB显色液，室温显色2～5 min(显微镜下控制显色时间为3～10 min)。终止显色，苏木素复染，脱水，二甲苯透明、封片。

1.2.2结果判定免疫组化染色以宫颈上皮细胞胞质或细胞核染成棕黄色为阳性判定标准。PI3K、ERK和IGF-1R大部分在细胞质内表达，偶见细胞核着色，ER主要在细胞核内表达，染色后出现棕黄色颗粒为阳性细胞。高倍镜下全视野观测，按阳性细胞在组织中所占面积分为5个等级：<5%为阴性(-)，5%～25%为弱阳性(+)，>25%～50%为阳性(++)，>50%～75%为中等度阳性(+++)，>75%为强阳性(++++)。阴性对照为等量PBS替代一抗的宫颈组织。

1.3统计学处理采用SPSS16.0统计软件进行分析，等级资料采用成组设计两样本比较的秩和检验，相关性采用等级相关Spearman秩相关系数和Pearson列联系数表示，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1宫颈炎与宫颈鳞癌组织中PI3K、ERK、IGF-1R和ER表达比较子宫颈鳞癌IGF-1R、PI3K阳性表达率(58.04%、92.41%)明显高于宫颈炎组织(13.33%、57.78%)，ER、ERK阳性表达率(22.32%、68.30%)低于宫颈炎组织(63.33%、95.56%)，差异有统计学意义(P<0.01)；汉族、维吾尔族子宫颈鳞癌IGF-1R、PI3K阳性表达率高于汉族、维吾尔族宫颈炎组织(P<0.01)；汉族、维吾尔族子宫颈鳞癌ER、ERK阳性表达率低于汉族、维吾尔族宫颈炎组织(P<0.01)；维吾尔族低分化宫颈鳞癌组织中IGF-1R、ERK表达低于原位癌组织(P<0.05)；ERK在维吾尔族子宫颈鳞癌组织中表达低于汉族，差异有统计学意义(P<0.01)，见图1及表1～2。

图1　　宫颈炎与子宫颈鳞癌组织中PI3K、ERK、IGF-1R和ER表达(IHC×400)

表1　　宫颈炎及子宫颈鳞癌组织中PI3K、ERK蛋白表达比较

续表1　　宫颈炎及子宫颈鳞癌组织中PI3K、ERK蛋白表达比较

a：P<0.01，与宫颈炎比较；b：P<0.01，与汉族宫颈炎比较；c：P<0.01，与维吾尔族宫颈炎比较；d：P<0.01，与汉族子宫颈鳞癌比较；e：P<0.01，与原位癌比较。

表2　　宫颈炎及子宫颈鳞癌组织中IGF-1R、ER蛋白表达比较

a：P<0.01，与宫颈炎比较；b：P<0.01，与汉族宫颈炎比较；c：P<0.01，与维吾尔族宫颈炎比较；d：P<0.05，与原位癌比较。

2.2PI3K、ERK、IGF-1R和ER间表达相关性维吾尔族子宫颈鳞癌组织中ERK、ER与PI3K呈正相关(r=0.34、0.23，P=0.00)，ERK与IGF-1R呈正相关(r=0.34，P=0.00)，ER与ERK相关(r=0.21,P=0.00)，PI3K、ER与IGF-1R相关(r=0.36、0.24，P=0.00)；各组标本中PI3K、ERK、ER和IGF蛋白表达，见表3。

表3　　各组标本中PI3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白表达(n)

3讨论

HPV感染是子宫颈癌的主要致病因素，其在诱导宫颈发生上皮内瘤变或恶性转变的过程当中，需要多种因素协同参与和相互作用[3]，有研究发现，ER在浸润型子宫颈鳞癌和子宫颈腺癌的阳性率均低于在正常宫颈组织中的表达，ER作为配体转录因子，与肿瘤的发生发展、宫颈癌细胞的生长及病变特性紧密相连[4]。

本研究中ER在子宫颈鳞癌中的阳性表达率(22.32%)低于宫颈炎组织(63.33%)，与Zhai等[5]结论一致。虽然本研究发现ER在维吾尔族、汉族子宫颈鳞癌中的阳性表达率(23.94%，13.89%)均低于宫颈炎组织(61.36%，65.22%)，差异有统计学意义(P<0.01)，但在两民族间比较，ER表达率差异无统计学意义(P>0.05)。ER在宫颈鳞癌组织中阳性率低表达的原因很可能是由于宫颈癌患者体内雌激素水平相对正常值较高，而大量雌激素与其受体结合导致受体水平降低。也可能是由于ERα异常甲基化导致其转录水平变化，从而导致蛋白质表达降低或缺陷[6]。由于ER蛋白在不同阶段宫颈病变组织中存在表达差异，可以运用检测ER蛋白的表达水平来预测宫颈病变的严重程度。

IGFs是一类多功能细胞增殖调控因子，已被证实其具有促进细胞有丝分裂、转移和抑制凋亡的作用，是重要的促肿瘤生长因子，IGF-1R被配体激活后与细胞增殖及肿瘤发生密切相关，其表达上调可以促进癌细胞的生长。有研究表明，IGF-1R阳性表达率越高，宫颈癌组织侵袭能力越强[7]。

本研究结果证实，在维吾尔族、汉族子宫颈鳞癌中IGF-1R的阳性表达率(55.85%，69.44%)高于宫颈炎组织(11.36%，15.22%)，差异有统计学意义(P<0.01)，维吾尔族、汉族组间IGF-1R表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。在对188例维吾尔族宫颈癌分析结果显示，低分化宫颈癌与原位癌比较差异有统计学意义(P<0.05)，说明IGF-1R阳性表达与宫颈分化程度有关。

本研究结果表明，ER在维吾尔族子宫颈鳞癌中低表达(23.94%)，且与IGF-1R存在相关性(r=0.24，P=0.00)，原因可能是患者体内高雌激素水平与IGF系统协同作用致IGF-1R表达增多，IGF-1R是雌激素调节蛋白，而高雌激素与受体结合导致ER水平降低。梁元姣等[8]报道临床上单纯抗雌激素治疗可使雌激素水平下降，游离ER增多，从而表现出IGF-1R高活性。宫颈癌的发生与卵巢甾体激素之间的联系已无可争议，IGF-1R水平与卵巢甾体激素水平均呈显著正相关，说明IGF系统与卵巢甾体激素在宫颈癌的发生过程中相互促进和协同[9]。

PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，由催化亚基和调节亚基构成的异源二聚体。免疫组织化学分析多种肿瘤及癌前病变发现PI3K基因突变和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B(AKT)的高磷酸化水平是肿瘤发生、发展的主要特征之一。PI3K/AKT信号通路参与多种肿瘤的发生进程，促进肿瘤细胞增殖生长和转化、抑制其凋亡等[10]，促进宫颈癌发生，在宫颈癌细胞中P13K蛋白表达显著增加[11]。本研究结果证实，PI3K在维吾尔族、汉族子宫颈鳞癌中的阳性表达率(93.09%，88.89%)高于宫颈炎组织(61.36%，54.35%)，差异有统计学意义(P<0.01)，结果同廖书杰等[12]一致。而维吾尔族、汉族组间的PI3K表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)，表明PI3K/AKT信号通路异常激活与宫颈癌细胞的增殖、浸润和转移存在相关性。

众所周知，丝裂原活化蛋白激酶家族(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)，参与细胞凋亡和周期的调控，在细胞生物学反应(如细胞增殖、分化、转化及凋亡等)的过程中具有至关重要的作用[13]，ERK作为细胞存活调节子，是MAPK信号通路中控制细胞存活、增殖和凋亡的关键角色[14]。据报道ERK蛋白在除了脑组织以外的各类上皮组织来源的肿瘤中表达水平均高于正常组织[15]，如在卵巢上皮癌组织中则有过高表达[16]。本研究中ERK在子宫颈癌中的阳性表达率(68.30%)低于宫颈炎组织(95.56%)，在维吾尔族、汉族子宫颈鳞癌中的阳性表达率(65.43%，83.33%)均低于宫颈炎组织(97.73%，93.48%)，差异有统计学意义(P<0.01)。ERK在维吾尔族、汉族宫颈鳞癌组织中表达比较，差异有统计学意义(Zc=2.85，P<0.01)。ERK是MAPK信号转导通路的三级激酶级联反应的重要因素，ERK相关的细胞内信号转导途径被认为是经典MAPK信号转导途径，ERK信号通路非常精确和复杂，不同刺激活化的ERK传递不同的信息，发生不同的生物学效应。研究中发现，ERK在不同民族间具有表达差异性，很可能是由于民族之间相异的某种机制导致ERK通路异常，影响了肿瘤细胞的增殖、侵袭及分化，从而抑制细胞凋亡的程度。

本研究发现，在维吾尔族子宫颈鳞癌组织中PI3K与IGF-1R(r=0.36，P=0.00)和ER(r=0.23，P=0.00)表达相关；ERK与IGF-1R(r=0.34，P=0.00)有相关性；上述相关性报道尚不多见，ERK和PI3K是MAPK信号转导通路的三级激酶级联反应的重要因素，而本研究中IGF-1R在维吾尔族子宫颈鳞癌组织中的表达与其有明显的相关性，IGF-1可通过下游激酶ERK、PI3K联合调节大量靶基因而发挥相互独立的抑制作用，且其受体水平对所调节基因的转录调节和下调也是独立的，由此推测ERK与PI3K可能作为共同靶点作用于IGF-1而改变IGF-1R与ER的相互调节作用。此外，ERK与PI3K显著相关(r=0.34,P=0.00)说明在维吾尔族子宫颈鳞癌的发生、发展过程当中PI3K/AKT和MAPK/ERK信号转导通路被同时激活，这在维吾尔族子宫颈鳞癌的发生、发展过程中至关重要。因此，找出针对ERK途径中各个环节的抑制物，用以切断信号转导的途径，从而达到预防和治疗新疆维吾尔族子宫颈鳞癌的目的。

新疆维吾尔族妇女子宫颈癌具有高发病、高病死率的特点，但其机制尚不清楚。因此，作者对ERK在维吾尔族子宫颈鳞癌组织中的研究结果可为进一步研究其发病机制奠定一定的基础。随着对多个蛋白表达深入研究，联合检测有望成为判断宫颈癌早期诊断及预后的肿瘤标志物，并为宫颈癌的靶基因治疗奠定基础，也作为维吾尔族宫颈癌机制研究的起点。

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Relation between cervical squamous cancer lesion among Uighur and Han ethnic women in Xinjiang with expression of PI3K,ERK,IGF-1R and ER protein*

DuJing1,RongXiaoling2,NingChao3,ShaJing4△

(1.TeachingandResearchingSectionofFunction,HigherVocationalCollege,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi,Xinjiang830011,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,SecondAffiliatedHospital,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi,Xinjiang830064,China;3.GraduateSchool,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi,Xinjiang830011,China;4.DepartmentofGynecologyandObstetrics,GeneralHospitalofXinjiangProductionandConstructionCorps,Urumqi,Xinjiang830002,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the expression levels of PI3K,ERK,IGF-1R and ER in cervicitis and cervical squamous cancer tissues among Uighur and Han ethnic patients and their correlation.MethodsThe 90 paraffin embedding samples of cervicitis tissue( 46 cases for Han and 44 cases for Uighur) and 224 paraffin embedding samples of cervical squamous cancer tissue(36 cases for Han and 188 cases for Uighur) were collected and detected the protein expression levels by using immunohistochemistry.ResultsThe positive expression rates of IGF-1R and PI3K in cervical squamous cancer were 58.04% and 92.41% respectively,which were higher than 13.33% and 57.78% in cervicitis tissue,the positive expression rates of ER and ERK in cervical squamous cancer were 22.32% and 68.30% respectively,which were lower than 63.33% and 95.56% in cervicitis tissue;the positive expression rate of IGF-1R and PI3K of cervical squamous cancer in Han and Uighur were 69.44%,88.89% and 55.85%,93.09% respectively,which were higher than 15.22%,54.35% and 11.36%,61.36% of cervicitis tissue;the positive expression rate of ER and ERK of cervical squamous cancer in Han and Uighur were 13.89%,83.33% and 23.94%,65.43% respectively,which were lower than 65.22%,93.48% and 61.36%,97.73% of cervicitis tissue respectively;the expression of ERK in Uighur cervical squamous carcinoma tissue was 65.43%,which was lower than 83.33% in Han,the difference was statistically significant (P<0.01).ConclusionPI3K,ERK,IGF-1R and ER protein expression positive or deficiency is closely related to the occurrence of cervical cancer,which may serve as the important biological indicators for detecting cervical cancer,and the ethnic difference of ERK protein expression exists in cervical cancer.

[Key words]uterine cervical neoplasms;phosphoinositide 3 kinase;extracellular signal-regulated kinase;receptor,IGF type1;receptors,estrogen

doi:论著·临床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.18.011

基金项目：自治区高校科研计划立项项目(XJEDU2012I24)；新疆医科大学科研创新基金项目(XJC201104)。

作者简介：杜靖(1974-)，副教授，硕士研究生导师，主要从事宫颈癌发病机制研究。△通讯作者，E-mail:1650195334@qq.com。

[中图分类号]R737.33

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)18-2484-04

(收稿日期：2015-11-18修回日期：2016-03-03)