氯代烃存在下覆盖层微生物甲烷氧化动力学

刑志林，张云茹， 张丽杰

(1.重庆理工大学　a.化学化工学院;b.药学与生物工程学院，重庆　400054； 2.重庆大学 城市建设与环境工程学院, 重庆　400045)



氯代烃存在下覆盖层微生物甲烷氧化动力学

刑志林1a，2，张云茹1b， 张丽杰1b

(1.重庆理工大学a.化学化工学院;b.药学与生物工程学院，重庆400054； 2.重庆大学 城市建设与环境工程学院, 重庆400045)

摘要：填埋气中挥发性氯代烃等非甲烷有机物对覆盖土中甲烷氧化有抑制效应。通过拟合不同抑制动力学方程考察了多种氯代烃对覆盖土微生物甲烷氧化的抑制形式，结果表明：氯代烃与甲烷之间主要为竞争性抑制(R2范围为0.937～0.999)。计算了不同氯代烃存在时的米氏常数KmI和氯代烃的解离常数KI，结果显示：1,1,2-三氯乙烷(KI=-30.111mg/L)和1-氯丙烷(KI=-24.323mg/L)对甲烷氧化有促进作用；氯代烯烃的竞争性抑制(KI为0.013～14.111mg/L)强于氯代烷烃(KI=0.215-278.515mg/L)；四氯乙烯的竞争性抑制效应最强，KI为0.013mg/L。该研究为强化覆盖层甲烷氧化和氯代烃共代谢生物降解提供了理论指导。

关键词：覆盖层；甲烷氧化菌；甲烷氧化；氯代烃；抑制动力学

在生活垃圾填埋场稳定化过程中，有机物的厌氧分解产生的填埋气(LFG)包括50%～60%的甲烷和5%～50%的二氧化碳[1-2]。据估计，填埋场每年约产生900～7 000万吨的甲烷，全球每年约有6亿吨的甲烷排放到大气中。此外填埋气中还包含大约1%的超过100种挥发性非甲烷有机物(NMOCs)，包括具有生物毒性的卤代脂肪烃和产生臭味的硫氧化物等[3-5]。LFG的排放对生态环境产生了严重影响，因此有效去除LFG对于填埋场实现真正的卫生填埋有重要意义。

分析覆盖土中甲烷与非甲烷有机物间的抑制关系，对于调控甲烷减排与氯代烃的共代谢降解有重要意义。然而，在前期研究中较少关注覆盖土中甲烷与多种氯代烃的抑制关系，或只关注有限几种氯代烃[12-13]，限制了甲烷氧化和氯代烃共代谢降解研究。基于此，本研究以覆盖土富集甲烷氧化菌为生物介质，以竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制3种抑制方程为基础，考察多种氯代烷烃、氯代烯烃的抑制形式，并基于不同氯代烃抑制方程，计算氯代烃解离常数，比较多种典型氯代烃的抑制能力。

1材料与方法

1.1实验材料

NMS液体培养基的配制参考文献[14]，所涉及氯代烃有二氯甲烷(DCM)、三氯甲烷(CF)、四氯化碳(CTC)、1,2-二氯乙烷(1,2-DCA)、1,1,2-三氯乙烷(1,1,2-TCA)、1,1,2,2-四氯乙烷(1,1,2,2-TeCA)、1-氯丙烷、1,3-二氯丙烷、1,2,3-三氯丙烷、顺-1,2-二氯乙烯(s-1,2-DCE)、反-1,2-二氯乙烯(t-1,2-DCE)、三氯乙烯(TCE)和四氯乙烯(PCE)，以上氯代烃均为分析纯，由重庆川东化工(集团)有限公司化学试剂厂生产。

所用微生物及培养方法参见文献[15]。

1.2实验方法

将富含甲烷氧化菌的覆盖土微生物培养至稳定期中，根据菌液浓度与菌液吸光度(OD600)的关系曲线y=3.8390x得到富集菌液的浓度。配置不同浓度的氯代烃水溶液。以一种氯代烃一种浓度为例，将培养好的菌液分装于5个100mL血清瓶中，添加0.5mL配置好的氯代烃水溶液，用丁基橡胶胶塞和铝盖密封。甲烷置换瓶中甲烷体积分别为2，3，5，7，10mL。监测初始甲烷浓度，每隔一段时间监测甲烷消耗量，计算甲烷氧化速率。设立批次实验，改变氯代烃种类和浓度，重复以上步骤。

1.3分析检测条件和方法

甲烷、氧气和二氧化碳采用气相色谱(川仪SC-6000A)测定，色谱条件:不锈钢色谱柱TDX8-12-25 2m，进样口温度、柱温和检测器(TCD) 温度分别为120 ℃,90 ℃,120 ℃，氮气为载气，载气流速为25mL/min，进样量为0.5mL。

1.4抑制动力学

甲烷氧化菌在甲烷单加氧酶作用下将甲烷氧化，反应过程符合Michaelis-Menten动力学：

(1)

式中：rs为底物消耗速率(mol/(gcell·h))；rmax为底物最大消耗速率(mol/(gcell·h))；Cs为底物浓度(mol/L)；Km为米氏常数(mol/L)。

当有抑制剂存在时，抑制剂的酶抑制分为以下几种情况：

1) 竞争性抑制。在反应过程中抑制剂I在酶的活性部位上结合，阻碍了酶与底物的结合，使酶催化底物的反应速率下降，底物最大消耗速率不受抑制剂影响。竞争性抑制方程如下：

(2)

式中:rSI为有抑制时底物消耗速率(mol/(gcell·h))；KmI为有竞争抑制时的米氏常数(mol/L)。KmI与抑制剂的关系：

(3)

式中：KI为抑制剂的解离常数(mol/L)；CI为抑制剂浓度(mol/L)。将式(3)带入式(2)，转化为：

(4)

式(4)即为竞争性抑制动力学方程。

2) 非竞争性抑制。抑制剂与酶分子的结合点不在酶催化反应的活性部位，底物与酶的结合并不影响抑制剂与酶的结合，而抑制剂与酶的结合却阻止底物与酶的结合，米氏常数保持不变，因此方程如下：

(5)

式中rI,max为存在非竞争性抑制时的底物最大消耗速率，与抑制剂的关系：

(6)

式中rI,max为非竞争抑制时的最大消耗速率。将式(6)带入式(5)转化为：

(7)

3) 反竞争性抑制：抑制剂不能直接与游离酶相结合，而只能与复合物(酶和底物)相结合生成三元复合物(酶底物抑制剂)。反竞争性抑制方程为：

(8)

rI,max和KmI与抑制剂关系为：

(9)

(10)

将式(9)和(10)带入式(8)，转化为：

(11)

2结果与讨论

2.1抑制动力学拟合

以抑制剂二氯甲烷、1,2-二氯乙烷和四氯乙烯为例，3种抑制形式的线性拟合如图1所示。

表1　不同抑制形式拟合的可决系数

表1(续)

2.2不同氯代烃的抑制动力学参数

由式(3)可知：KI> 0，KI减小，则KmI增大，表明底物与酶的结合能力降低。根据竞争性抑制动力学原理，通过拟合直线的截距和斜率可以得到KmI，再根据式(3)以KmI对CI作图即可得到不同氯代烃的解离常数KI，拟合结果如表2所示。由表2可以看出：1,1,2-三氯乙烷和1-氯丙烷的解离系数分别为-30.111 mg/L和-24.323 mg/L，KmI的变化范围分别为0.042～0.066和0.076～0.093，明显小于无氯代烃的Km(空白组1为0.103)，说明该两种氯代烃在浓度为0.1～10mg/L和0.14～3.4mg/L的范围内不仅没有抑制甲烷氧化菌活性，在一定程度上强化了甲烷氧化。Zhao等[18]发现氯仿浓度小于80mg/L时可促进兼性甲烷氧化菌MethylocystisstrainJTA1的活性。

除1,1,2-三氯乙烷和1-氯丙烷外，实验条件下其他氯代烃对覆盖土微生物均表现为竞争性抑制。竞争性抑制时的米氏常数KmI变化范围为0.115～1.06和0.209～1.276，高于对应的空白组0.103和0.200。随着氯代烃浓度的增大，KmI增大，抑制效应增大。氯代烃的解离常数KI变化范围为由四氯乙烯的0.013 mg/L到1,2-二氯乙烷的278.515 mg/L，说明四氯乙烯在较低的浓度时(0.003 75～0.188 mg/L)对该覆盖土微生物就有很强的抑制效应，而1,2-二氯乙烷(0.216～21.75 mg/L)只有微弱的影响。就氯代烃的结构而言，氯代烯烃的解离常数变化范围为0.013～14.111 mg/L，氯代烷烃的解离系数变化范围为0.215～278.515 mg/L，说明氯代烯烃有更强的抑制效应；而氯原子数与解离系数并无明显关系，说明氯代烃的饱和程度影响抑制程度。Albanna等[18]以三氯乙烷、三氯乙烯和二氯乙烯的混合物为抑制剂研究不同温度对覆盖土的抑制效应，结果显示：混合抑制剂的解离常数的变化范围为0.088～0.462 mg/L，且随温度的增加(5 ℃～35 ℃)抑制效应也随之增加。

表2　竞争性抑制拟合结果

表2(续)

3结束语

覆盖土微生物在填埋气去除，包括甲烷氧化和挥发性氯代烃等非甲烷有机物生物降解中起重要作用。本研究表明：对于甲烷单加氧酶而言，甲烷和多种氯代烃之间存在竞争性抑制，这对于强化不同氯代烃的共代谢生物降解有重要意义。作为复杂的次生环境，覆盖土中微生物种类和功能还未得到全部认清，已有研究表明[15]：覆盖土中存在有其他可直接降解氯代烃的微生物和苯酚羟化酶等共代谢降解酶，也说明氯代烃对于覆盖土微生物不只有一种存在形式。充分认识氯代烃在微生物中与酶的结合形式及多种抑制形式的主导机制，对于从分子水平调控覆盖层中氯代烃的生物降解有指导作用。

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(责任编辑何杰玲)

Kinetics of Methane Oxidation by Microorganism in LandfillCoverSoilinthePresenceofChlorinatedHydrocarbons

XING Zhi-lin1a, 2, ZHANG Yun-ru1b, ZHANG Li-jie1b

(1.a.College of Chemistry and Chemical Engineering;b.CollgeofPharmacyandBiologicalEngineering,ChongqingUniversityofTechnology,Chongqing400054,China;2.UrbanConstructionandEnvironmentalEngineering,ChongqingUniversity,Chongqing400045,China)

Abstract:Non-methaneorganiccompoundsinlandfillgassuchasvolatilechlorinatedhydrocarbonshadinhibitingeffecttomethaneoxidation.Inhibitionformofcoversoilmicrobemethaneoxidationforvariouschlorinatedhydrocarbonwasinvestigatedbymatchingseveralkineticsequations.Theresultsshowthatthemaininhibitionformbetweenchlorinatedhydrocarbonsandmethaneiscompetitiveinhibition(R2:rangingfrom0.937～0.999).BycalculatingKmIandchlorinatedhydrocarbondissociationconstantsKIundertheconditionofdifferentchlorinatedhydrocarbons,theresultshowsthat1, 1, 2-trichloroethane(KI= 30.111mg/L)and1-chloropropane(KI=24.323mg/L)couldpromotethemethaneoxidation.Competitiveinhibitionofchlorinatedrubber(KI:rangingfrom0.013～14.111mg/L)isbetterthanchlorinatedparaffin(rangingfrom0.215～278.515mg/LofKI).Amongthem,competitiveinhibitioneffectoftetrachloroethyleneisthestrongest(KI= 0.013mg/L).Thestudyprovidesatheoreticalguidanceforstrengtheningofmethaneoxidationandchlorinatedhydrocarbonmetabolicbiodegradationofcoveringlayer.Keywords:coveringlayer;methanotroph;methaneoxidation;chlorohydrocarbon;inhibitionkinetics

收稿日期：2016-01-24

基金项目：重庆市基础与前沿研究资助项目(cstc2013jcyjA20009)

作者简介：刑志林(1988—)，男，博士研究生，主要从事环境微生物和固废处理研究； 通信作者 张云茹(1977—)，女，副教授，主要从事环境微生物、生化工程等方面的研究。

doi:10.3969/j.issn.1674-8425(z).2016.06.014

中图分类号：X172

文献标识码：A

文章编号：1674-8425(2016)06-0083-08

引用格式：刑志林，张云茹， 张丽杰.氯代烃存在下覆盖层微生物甲烷氧化动力学[J].重庆理工大学学报(自然科学)，2016(6):83-90.

Citationformat：XINGZhi-lin,ZHANGYun-ru,ZHANGLi-jie.KineticsofMethaneOxidationbyMicroorganisminLandfillCoverSoilinthePresenceofChlorinatedHydrocarbons[J].JournalofChongqingUniversityofTechnology(NaturalScience)，2016(6):83-90.