油菜菌核病相关的WRKY转录因子研究进展

尹明智，胡 燕

(遵义师范学院生命科学学院，贵州遵义 563002)



油菜菌核病相关的WRKY转录因子研究进展

尹明智，胡 燕

(遵义师范学院生命科学学院，贵州遵义 563002)

摘要介绍了WRKY转录因子的结构特点，综述了WRKY转录因子在植物防卫反应中的作用以及在油菜菌核病防卫调控机制中的研究，在此基础上，提出了研究WRKY转录因子可能为油菜菌核病防治及抗病育种提供新的思路。

关键词油菜；菌核病；WRKY转录因子

油菜是我国的主要油料作物，而由核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)引起的菌核病是制约油菜生产的重要因素。菌核病在我国各油莱产区均有发生，一般发病率为10%～30%，严重时达80%以上，造成减产10%～70%，含油量降低1%～5%，严重影响油菜的产量和品质，造成巨大的经济损失[1]。而在美国，每年由核盘菌引起的经济损失可达2亿美元[2]。目前，选育油菜抗病品种是防治油菜菌核病的有效方法之一，育种家通过抗性鉴定筛选到高抗油菜菌核病的油菜新品种应用于生产，但至今尚未筛选到油菜免疫菌核病的品种或种质资源[3]。

培育抗(耐)病油菜品种是防治菌核病最经济有效的途径，而深入了解核盘菌的致病机理及油菜抗病的遗传调控是有效开展油菜抗病育种的基础。研究表明，植物WRKY基因的转录受到多种生物和非生物胁迫的调控。当植物受到不同病原物侵染以及防御信号物质诱导时，WRKY基因的表达都有显著变化，从而调节不同的防卫反应[4]。笔者综述了与油菜菌核病相关的WRKY转录因子的研究进展，旨在为油菜菌核病防治及抗病育种提供参考。

1WRKY转录因子结构域

WRKY转录因子因含有保守的WRKY结构域而得名，WRKY结构域是WRKY蛋白生物学活性必需的。WRKY结构域约由60个氨基酸残基组成，其靠近氨基末端有7个保守的氨基酸残基WRKYGQK和锌指结构，属于锌指型(Zinc-finger type)转录调控因子[5]。WRKYGQK是WRKY结构域的核心序列(图1)[6]，该序列发生变化可能导致结构域减弱甚至失去DNA结合活性[7]。研究表明，WRKY因子的结构域特异性地与(T)(T)TGAC(C/T)的DNA序列，即W-box相互作用，其中，该序列中的TGAC保守核心序列是固定不变的[8]。通过凝胶电泳迁移改变试验发现W-box保守核心序列中的TGAC任一核苷酸被替换，WRKY转录因子与之结合的能力将大幅下降或完全消失，同时，WRKY转录因子与W-box的结合还需要Zn2+等金属离子的参与和磷酸化作用等[9]。研究表明，在植物防御途径相关基因启动子上至少存在一个W-box，如欧芹WRKY1基因启动子上有多个W-box，相互靠近成回文结构，增强了基因与WRKY蛋白的结合能力[10]。因此，WRKY转录因子可能通过与功能基因或其他调控因子基因启动子中的W-box结合，调节下游功能基因的表达或调控因子基因的表达，从而参与植物的防卫反应、生长发育等各种生理活动的调节作用[11-12]。

2WRKY转录因子与植物防卫反应

WRKY转录因子是植物抵御病原体信号途径的重要组成部分，其广泛参与防卫反应的调控，组成一个复杂且高度互作调控的网络，从多个水平参与植物抗病反应的调控，它们直接或间接调控下游的目标基因，激活或抑制其他转录因子的表达(图2)[13]。许多植物在受到病原菌或SA胁迫时，能够迅速地诱导一系列WRKY基因的表达。用SA诱导处理拟南芥时，发现有49个AtWRKY转录因子被激活[7]。Duan等[14]发现毛果杨PtrWRKY73转录因子响应SA的诱导。通常WRKY转录因子通过直接或间接地激活目标基因，参与植物对病原物的防卫反应。有些WRKY转录因子能起正调控作用，而有些发挥负调控作用。如拟南芥的转录因子AtWRKY3和AtWRKY4在植物对腐生病原菌抗性中起正调控作用，其突变体能使拟南芥对真菌的敏感性增加[15]；拟南芥WRKY转录因子AtWRKY29被瞬时表达后减弱了病菌侵染拟南芥叶片的症状[16]，AtWRKYl8和AtWRKY70超表达能增强拟南芥对致命病原体的抗性，提高抗病能力[17-18]，AtWRKY33可以提高拟南芥对死体营养型病菌灰霉病的抗性，且在防御灰霉病信号途径中是必需的，当AtWRKY33基因突变后，拟南芥JA途径关键基因的表达受到抑制[19]。在水稻中，OsWRKY13过表达可以增强其对白叶枯病和稻瘟病的抗性，抑制病害的侵染[20]。当OsWRKY45的表达量降低时，水稻对稻瘟病的抗性也随之降低，同时瞬时表达发现OsWRKY45可以结合W-box并激活SA信号途径NHl基因的表达水平，从而使水稻的抗病性增强[21]。研究表明，过量表达OsWRKY03和OsWRKY71可以增强水稻对白叶枯病的抗性，进一步基因芯片分析发现过量表达OsWRKY71基因可使与防御相关的基因表达上调[22]。而AtWRKY48在对假单胞菌(Pseudomonassyringae)有毒小种的基础抗性中起负调控作用[23]。水稻转录因子OsWRKY62过表达后会损害抗白叶枯病基因Xa21的作用，且抑制防御相关基因的激活，表现出对水稻先天免疫的负调节[24]。WRKY转录因子的调控方式多样，有些WRKY转录因子在防卫反应中具有双重调控作用。如AtWRKY53突变体对真菌(R.solanacearum)的抗性减弱，而对假单胞菌(P.syringae)的抗性增强[25]。超表达AtWRKY41拟南芥对假单胞菌有毒小种抗性增强，对软腐病菌(Erwiniacarotovora)抗性减弱[26]。王美容[27]研究发现，过表达BnWRKY28后植株对真菌性病害灰霉病菌抗性减弱，说明BnWRKY28很可能参与正调控SA抗病信号途径而负调控JA抗病信号途径。

注：红色WRKYGQK序列为核心序列Note：Red sequence WRKYGQK as core sequence.图1　WRKY转录因子结构域序列Fig.1　Domain sequence of WRKY transcription tactor

图2　WRKY转录因子介导防卫反应调控网络Fig.2　WRKY Web in the defense response

3WRKY转录因子与油菜菌核病防卫反应

拟南芥作为油菜的近缘模式植物，为油菜研究提供重要参考。赵丽[3]利用拟南芥突变体分析了WRKY家族对核盘菌抗性的调控功能。接种核盘菌后，AtWRKY6、AtWRKY8和AtWRKY11基因表达量显著上调；与野生型植株相比，接种核盘菌后wrky6和wrky8拟南芥突变体的病害症状显著加重，而wrky69和wrky70突变体则减轻；与野生型相比，接种后wrky6和wrky8突变体菌丝生长较快量大，wrky70较慢量少。基因表达谱分析结果显示，AtWRKY6和AtWRKY8正调控、而AtWRKY69和AtWRKY70负调控拟南芥对核盘菌的抗性。这些WRKY基因可能通过激活多条途径实行其抗核盘菌调控功能。AtWRKY28和AtWRKY75超表达引起寄主植物的氧化迸发从而抑制了核盘菌菌丝生长和侵入寄主植物，表达谱分析表明，它们是水杨酸、茉莉酸/乙烯依赖的防卫反应信号途径的转录因子，能激活茉莉酸/乙烯途经来抵御核盘菌侵染和草酸胁迫，提高拟南芥对草酸和核盘菌的抗性[28]。研究发现，草酸能显著诱导拟南芥AtWRKY63的表达，其过表达植株对核盘菌的抗性显著增强。进一步分析表明，AtWRKY63是通过诱导植物的氧爆发、抑制核盘菌菌丝的生长来抵御核盘菌的侵染，并能激活水杨酸与茉莉酸依赖的抗病信号途径，从而增强对核盘菌的抗性[29]。王继鹏[30]采用芯片表达谱技术分析了接种核盘菌前后油菜叶片的基因表达谱，发现有1 072个差异表达在2倍以上的基因，其中，接种后上调表达基因531个，下调表达基因541个。差异表达基因中有15个与钙离子信号通路相关。药理学研究结果显示，CaCl2调节剂的处理显著诱导包括AtWRKY11在内的一组钙离子信号转导基因的表达，且拟南芥WRKY11突变体对核盘菌抗性显著下降。

关于油菜菌核病相关WRKY转录因子的研究较少。利用拟南芥基因芯片分析核盘菌接种具有局部抗性和敏感的油菜植株，分别发现了686和1 547个表达差异基因。这些差异表达基因的功能可能涉及病程相关蛋白、氧化迸发、非生物胁迫及部分未知蛋白。进一步的QTL分析鉴定了一些候选抗性基因，其中，WRKY转录因子和与植物细胞壁形成相关的蛋白可能在油菜抗核盘菌中发挥重要作用[31]。Yang 等[32]确定了46个油菜的WRKY转录因子，并将它们分为三大组，分别用核盘菌和白菜黑斑病菌接种油菜，使用qPCR方法检测油菜中16个油菜WRKY转录因子的表达情况，结果表明，有13个转录表达量增加，2个转录表达量减少，1个转录表达量在油菜被侵染12 h后下降，72 h后增加。姚飞[33]通过构建BnWRKY40正义与反义表达载体，转化烟草和油菜获得了阳性转化植株，初步鉴定表明其受核盘菌诱导表达。王亚婷[34]对获得的油菜BnWRKY75正义、反义转化子接种核盘菌后的β-1，3-葡聚糖酶活性进行了检测，结果表明，BnWRKY75基因在油菜防御核盘菌反应中为负调控因子。油菜BnWRKY33转录因子对核盘菌的侵染表现出高度敏感，超表达BnWRKY33的油菜植株明显增强了其对核盘菌的抗性，核盘菌侵染时组成性激活了BnPRl和BnPD1.2基因的表达并抑制了H2O2的积累，进一步分析表明BnWRKY33超表达植株对核盘菌的抗性可能与水杨酸和茉莉酸介导的抗性反应的激活以及抑制H2O2的积累有关[35]。张秋平[36]利用转录组测序技术研究发现，油菜菌核病感病材料接种前后差异表达2倍以上的基因有31 532个，其中，持续上调表达基因有2 702个，持续下调的1 611个；抗病品种接种前后差异表达2倍以上的基因有31 608个，其中，持续上调表达的有3 204个，持续下调表达的有3 213个。参与乙烯、茉莉酸和ABA合成和信号转导路径的酶、转录因子等在接种前后以及抗感品种中差异显著。

4问题与展望

WRKY转录因子在植物防卫反应中作为正负调控因子介导下游相关防御基因的表达，从而在植物生物胁迫防御系统中发挥重要功能，然而其分子机理有待进一步研究。研究表明，WRKY转录因子参与调节植物的多种生物学过程，参与植物与病原物的互作效应，但目前研究主要集中在基因克隆、序列分析及其功能鉴定上。WRKY转录因子调控的植物防卫反应机制尚未明确。目前结合多种生化分析技术、质谱分析技术、蛋白质组学、转录组学、代谢组学等技术手段可用于转录因子的鉴定和体外相关分析，甚至获得与全部WRKY转录因子相关的所有信息，更详尽地解析WRKY转录因子调控网络。通过杂交方法选育抗菌核病油菜品种周期较长，且尚未发现对菌核病免疫的油菜品种。目前，对油菜的抗病机制有一定的研究，但尚未清晰地阐述油菜抗菌核病的调控机制，而WRKY转录因子可以调控下游大量防御基因的表达，因此，运用转基因手段研究油菜WRKY转录因子的调控机制，以期为油菜菌核病防治及抗病育种提供新的思路。

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基金项目遵义师范学院校级课题(遵师BS[2014]25号)。

作者简介尹明智(1983- )，男，湖南郴州人，副教授，硕士，从事油菜遗传育种研究。

收稿日期2016-03-28

中图分类号S 503

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)13-146-03

Research Progress ofSclerotiniasclerotiorumRelated WRKY Transcription Factor in Rapeseed

YIN Ming-zhi, HU Yan

(College of Life Science, Zunyi Normal College, Zunyi, Guizhou, 563002)

AbstractThe structure characteristics of WRKY transcription factor were introduced. The role of WRKY transcription factor in plant defense response and its regulation mechanism in the defense to Sclerotinia sclerotiorum were studied. And the new idea for the control of Sclerotinia sclerotiorum and the resistance breeding of rapeseed variety was provided through the research.

Key wordsRapeseed; Sclerotinia sclerotiorum; WRKY transcription factor