7种松科植物松针提取物的体外抗氧化活性比较1)

马承慧　王群　　　　刘牧

(东北林业大学，哈尔滨，150040)　　　　(北京林业大学)



7种松科植物松针提取物的体外抗氧化活性比较1)

马承慧王群刘牧

(东北林业大学，哈尔滨，150040)(北京林业大学)

摘要以油松、雪松、红松、日本冷杉、青海云杉、樟子松和蓝粉云杉7种松科植物的松针为实验原料，以二苯基苦味肼基自由基(DPPH自由基)清除率、羟自由基清除率和总还原能力为指标，比较7种松科植物松针提取物酚类物质质量分数及其抗氧化能力的差异，并分析抗氧化活性与其多酚、黄酮和原花青素质量分数之间的相关性。实验结果表明，7种松科植物松针提取物的多酚质量分数介于29.72～54.21 mg/g ，其中油松的多酚质量分数最高；黄酮质量分数介于6.72～11.06 mg/g，其中雪松的黄酮质量分数最高；原花青素质量分数介于2.26～7.29 mg/g，其中雪松的原花青素质量分数最高。DPPH自由基清除能力的IC50值最低的为油松，羟自由基清除能力的IC50值与总还原能力EC50值最低的均为雪松。相关性分析表明，多酚质量分数与DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力和总还原能力均存在显著相关性，在抗氧化能力中起到了主要作用。因此，松针多酚因其具有较好的抗氧化能力可作为一种天然的抗氧化剂。

关键词松科植物；松针；多酚；抗氧化

植物多酚类化合物是一类拥有一个或多个芳香环并含有一个或几个羟基基团的混合物，一般分为黄酮类化合物、木脂素类化合物、儿茶素和原花青素类化合物等，其广泛存在于植物体内[1-2]。目前，国内外学者对植物多酚的生理功能开展了深入的研究[3]。结果发现，植物多酚类物质具有良好的抗氧化能力，能够将氧化进程抑制或者中断，并且平衡机体自由基的数量[4]，可预防氧化应激所引发的如动脉粥样硬化、心脑血管疾病、老年痴呆症、帕金森氏病、肿瘤等疾病[5-6]。松科植物体内含有大量多酚类的化合物，其具有独特的化学性质和生物活性，因此将其称为松多酚[7]，在松科植物中多酚类化合物也往往和糖类、多酚类化合物通过糖苷键结合，其功能也往往表现出这些复合物的特性[8]。研究表明松多酚具有抗肿瘤、降血糖、降血脂、防治心脑血管疾病，以及抑菌等多种生理功能[9-13]。

由于松科植物种类多样，针对红松、法国海岸松、落叶松等松科植物体内多酚研究的报道较多，而关于其它松科及种类间的多酚质量分数差异及抗氧化性能力的研究尚未见报道。本研究选用红松、油松、雪松、樟子松、蓝粉云杉、日本冷杉和青海云杉7种松科植物，测定并比较其多酚、黄酮和原花青素质量分数；选用DPPH自由基清除率、羟自由基清除率和总还原能力为指标，探讨其抗氧化能力之间的差异，同时分析多酚类物质质量分数与其抗氧化能力的相关性，为松科植物资源的开发利用与多酚的深入研究提供依据。

1材料与方法

1.1材料

油松、雪松、蓝粉云杉、日本冷杉和青海云杉取自北京；红松、樟子松取自哈尔滨，采集时间2014年5月份，采集成熟针叶。松针样品低温干燥后粉碎过40目筛备用。

1.2方法

1.2.1松针多酚的提取

准确称量5 g经过烘干并且脱脂后的松针粉，以体积分数60%的乙醇为溶剂，m(样品)∶V(溶剂)=1 g∶30 mL(料液比)，60 ℃水浴4 h，抽滤、离心后得松多酚提取液，将松多酚提取液浓缩干燥后，得到多酚样品。

1.2.2DPPH自由基清除能力的测定

分别取配置成一系列质量浓度的多酚溶液1 mL，加入3 mL 10-4mol/L二苯基苦味肼基自由基(DPPH)混匀，室温放置30 min后，在波长517 nm处测定吸光值Ai，用无水乙醇代替DPPH测定吸光值Aj，以无水乙醇代替多酚溶液测定吸光值A0，平行实验3次取平均值，按下式计算松多酚对DPPH自由基的清除能力。

清除率=(1-(AiAj/A0))×100%。

1.2.3羟自由基清除能力的测定

分别取配置成一系列质量浓度的多酚溶液1 mL，加入1 mL的1 mmol/L FeSO4溶液，1 mL 1 mmol/L过氧化氢溶液，2 mL的3 mmol/L水杨酸溶液混匀，室温放置30 min后，在波长510 nm处测得吸光值Ai，用蒸馏水代替水杨酸测定吸光值Aj，用蒸馏水代替多酚溶液测定吸光值A0，平行实验3次取平均值，清除率计算公式同1.2.2。

1.2.4总还原能力的测定

分别取配置成一系列质量浓度的多酚溶液1 mL，加入2.5 mL 0.2 mol/L pH为6.6的磷酸盐缓冲液，2.5 mL 1%铁氰化钾溶液。50 ℃水浴20 min，流水冷却后加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，以3 000 r/min速度离心10 min。取2.5 mL的上清液加入2.5 mL蒸馏水和1 mL 0.1%的三氯化铁溶液，室温放置10 min，在700 nm波长下测定吸光值；以蒸馏水代替松多酚提取物调零，平行实验3次取平均值。

1.2.5酚类物质质量分数的测定

多酚质量分数的测定：采用国标方法，以没食子酸制作标准曲线，具体方法参见文献[14]。

黄酮质量分数的测定：采用国标方法，以芦丁制作标准曲线，具体方法参照文献[15]。

原花青素质量分数的测定：采用正丁醇盐酸法测定，具体方法参照文献[16]。

1.2.6数据分析

用SPSS 19.0统计软件进行方差分析、差异显著性比较、IC50值和EC50值的计算及相关性分析。

2结果与分析

2.1DPPH自由基清除能力比较

DPPH自由基的清除率可以用来评价单一或混合多酚类化合物的抗氧化活性，测定DPPH自由基清除率的方法具有简单快速等优点[17]。二苯基苦味肼基自由基(DPPH自由基)遇到松针多酚时，与其多酚中的酚羟基结合或发生替代，使得游离的DPPH自由基的数量减少，在其特征吸收光下吸收减小，表现为由紫色变为淡黄色[18]。7种松科植物松针多酚对DPPH自由基的清除率如图1。可知，7种松针多酚对DPPH自由基的清除率存在量效关系，其质量浓度的增加可显著增强DPPH自由基的清除作用；当质量浓度达到一定值后，DPPH自由基清除率达到最高限度，不再随样品质量浓度的升高而增加。油松、蓝粉云杉的松针多酚在0～150 mg/L的质量浓度范围内，随着质量浓度的增加，DPPH自由基的清除作用显著增强；当质量浓度达到150 mg/L之后，随样品质量浓度升高，DPPH自由基清除作用增加不显著。雪松的松针多酚在0～180 mg/L的质量浓度范围内，DPPH自由基的清除作用显著增强；当质量浓度达到180 mg/L之后，DPPH自由基清除作用增加不显著。红松、樟子松、青海云杉和日本冷杉的松针多酚当质量浓度达到200 mg/L之后，DPPH自由基清除作用达到最大值。7种松针多酚最终所达到的最大清除率从大到小依次为：雪松、油松、日本冷杉、蓝粉云杉、红松、青海云杉、樟子松。

图1　DPPH自由基清除能力

2.2羟自由基清除能力的比较

羟自由基具有较强的得电子能力，会诱导DNA链断裂和碱基改性从而引起如癌症等一系列疾病。羟自由基在Fenton体系中产生(Fe2++H2O2→Fe3++HO·+OH-)[19]。在实验中加入松多酚这种具有抗氧化活性的物质，可以直接清除羟自由基或阻断Fenton反应，从而减少羟自由基的产生量。7种松科植物松针多酚对羟自由基的清除率见图2。可知，随着样品质量浓度的增加，7种松多酚对羟自由基的清除率逐渐上升，当质量浓度达到一定值以后，清除率随着质量浓度的增加变化缓慢且趋为平缓，即清除能力达到了最高限度。油松、蓝粉云杉、雪松、日本冷杉、青海云杉、樟子松和红松质量浓度分别达到0.60、1.00、0.35、3.50、2.50、0.80、0.80 g/L时，羟自由基清除作用达到最大值。7种松针多酚最终所达到的最大清除率从大到小依次为：油松、红松、雪松、樟子松、蓝粉云杉、日本冷杉、青海云杉。

图2　羟自由基清除能力

2.3总还原能力的比较

采用普鲁士蓝法测定总还原力，氰离子在抗氧化剂自身还原作用下与硫酸亚铁作用生成亚铁氰络盐，酸化后与高铁离子生成普鲁士蓝。普鲁士蓝在700 nm波长下有最大吸收峰，因此多酚化合物的抗氧化性越强，其吸光度越大。7种松科植物松针多酚的总还原能力见图3。可知，7种松科植物松针多酚的总还原能力与质量浓度之间均呈现出显著的线性相关，油松、蓝粉云杉、雪松、日本冷杉、青海云杉、樟子松和红松的相关系数分别为：0.964 4、0.997 6、0.979 6、0.993 3、0.991 7、0.997 5和0.983 8。总还原能力从大到小依次是雪松、蓝粉云杉、油松、日本冷杉、樟子松、红松和青海云杉。

图3　总还原能力

2.4抗氧化活性的IC50和EC50值比较

IC50值表达的是自由基清除率达到50%时所需要的抗氧化剂质量浓度，EC50值表达的是总还原能力中吸光值为0.5时所需要的抗氧化剂质量浓度，IC50值和EC50值与抗氧化能力呈逆相关。7种松针多酚的DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力的IC50值和总还原能力的EC50值见表1。可知，油松松针多酚清除DPPH自由基的IC50值最小，因此在较小质量浓度下油松松针多酚清除DPPH自由基的能力要大于同等质量浓度的其他松科植物，显示出极强的清除DPPH自由基的能力。樟子松对羟自由基清除能力的IC50值最小，在较小质量浓度下樟子松松针多酚清除羟自由基的能力要大于同等质量浓度下的其他松科植物。雪松松针多酚总还原能力的EC50值低于其他几种松科植物。

表1DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力的IC50值

和总还原能力的EC50值

mg·L-1

注：表中数值为平均值±标准差。

2.5主要抗氧化物质质量分数与抗氧化活性相关性分析

2.5.1主要抗氧化物质质量分数

7种松针多酚的抗氧化成分质量分数见表2。

表27种松针中多酚、黄酮、原花青素质量分数

mg·g-1

注：表中数值为平均值±标准差；同列不同小写字母代表差异显著，p<0.05。

2.5.2相关性分析

7种松针多酚的抗氧化活性(表3)与其主要抗氧化物质质量分数(表2)的相关性见表4。

表3　7种松多酚抗氧化活性

注：DPPH自由基清除率为最大可达到值；羟自由基清除率为最大可达到值；总还原能力测定中样品质量浓度为800 mg/L。

相关性分析结果表明，多酚质量分数与DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力和总还原能力都具有显著相关性，多酚分子中含有的大量酚羟基结构是其抗氧化性能的关键，酚羟基作为氢的供体，捕捉氧化过程中产生的自由基，从而终止自由基引发的氧化进程。这说明了多酚类物质中能提供电子的物质与多酚质量分数呈正相关。黄酮质量分数只与总还原能力有显著的相关性，原花青素质量分数与DPPH自由基清除能力和总还原能力有显著相关性，这可能与其质量分数较少、富集位置不同有关。因此松科植物松针中多酚物质与其抗氧化能力间的关系密切，说明多酚是松科植物松针中抗氧化的重要物质之一。

表4　主要抗氧化物质质量分数与抗氧化活性相关性分析

注：*在0.05水平(双侧)上显著相关；** 在0.01水平(双侧)上显著相关。

3结论与讨论

分析7种松科植物松针中多酚类物质的质量分数及其抗氧化作用，发现不同松科植物中多酚、黄酮和原花青素的质量分数存在显著差异，其中多酚质量分数最高的为油松，黄酮和原花青素质量分数最高的均为雪松。体外抗氧化活性实验结果表明7种松多酚均可以有效地清除生理和非生理自由基(羟自由基和DPPH自由基)，在清除DPPH自由基方面，雪松具有最大清除率，油松IC50值最小；清除羟自由基方面，油松具有最大的清除率，樟子松IC50值最小；雪松的总还原能力最大。因此综合看来，雪松与油松的抗氧化性高于其他5松科植物。分析主要抗氧化物质质量分数与抗氧化能力间的关系，发现多酚质量分数与DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力和总还原能力都具有显著相关性，表明多酚是松科植物松针中抗氧化的重要物质之一。

研究表明自由基可以引起膜脂LPO，蛋白质(蛋白羰基构造PC)和核酸分子的氧化性损伤，机体中多种抗氧化剂如GSH、GST、CAT、SOD、GPx和DR协同作用保持自由基的质量浓度相对较低[11]，但由于饮食的不健康、环境污染严重、生活压力大都会导致自由基的增加，而自由基或氧化剂会将细胞和组织分解，影响正常的代谢功能，并会引起不同的健康问题[20]。因此近年来对天然植物中抗氧化活性成分的研究越来越多。多酚化合物广泛分布于植物体中，具有较好的抗氧化性能。目前国内植物多酚的来源多为茶叶、水果、谷物及一些常见的坚果等。本实验从7种松科植物针叶提取的粗多酚质量分数最高，为(54.21±1.58)mg/g，坚果中多酚质量分数较高的为核桃((12.52±0.03)mg/g)[21]，浆果中多酚质量分数最高的为花楸(6.25 mg/g)[22]，杂粮中多酚质量分数较高的为苦荞((2.845 6±0.100 0)mg/g)，主粮中质量分数较高的为小麦((0.191 1±0.010 0)mg/g)[23]，常见的一些水果和蔬菜多酚质量分数：苹果(2.09 mg/g)[24]、香蕉(0.406 5 mg/g)、西红柿(0.643 8 mg/g)、西葫芦(0.105 4 mg/g)、土豆(0.314 9 mg/g)[25]等。7种松科植物的松针中均富含多酚，且具有较强的抗氧化活性。同时松科植物在我国分布广泛，具有显著的资源优势。因此松针作为植物多酚重要来源，已成为一种无毒副作用的天然抗氧化剂，在食品、化妆品、保健品和医药等领域广泛应用。

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Antioxidant Activity of Seven Pinaceae Plant Extracts from Pine Needlesinvitro

Ma Chenghui, Wang Qun

(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China); Liu Mu(Beijing Forestry University)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(6)：45-48.

With seven pine needles fromPinussylvestris,Cedrusdeodara(Roxb.) G. Don,Pinuskoraiensis,Abiesfirma,Piceacrassifolia,PinustabuliformisandPiceapungens, and taking scavenging rate of DPPH free radicals, hydroxyl free radicals and the total reducing power of them as indexes, we related the antioxidant capacity of different Pinaceae extracts from the seven pine needles to the phenolics content and analyzed the correlation between the antioxidant activity and the content of phenols, proanthocyanidins and flavonoids. The polyphenol content of Pinaceae extractes from the seven pine needles was in 29.72-54.21 mg/g, andPinustabulaeformiscontains the highest polyphenols content. The flavonoids content was in 6.72-11.06 mg/g, andC.deodarawas with the highest flavonoids content. The proanthocyanidins content was in 2.26-7.29 mg/g, andC.deodarawas with the highest content of proanthocyanidins.Pinustabulaeformishas the lowest IC50value of scavenging rate of DPPH free radicals.C.deodarawas with the lowest IC50value of scavenging rate of hydroxyl free radicals and the lowest EC50value of the total reducing power. The scavenging rate of DPPH, hydroxyl free radicals and reducing power were positively correlated to the content of polyphenol which played a major role in antioxidant properties. Pine needle polyphenols had good antioxidant capacity, and can be used as a kind of natural antioxidant.

KeywordsPinaceae plants； Pine needles； Polyphenols； Antioxidant activity

第一作者简介：马承慧，女，1959年7月生，东北林业大学林学院，高级工程师。E-mail：515026498@qq.com。

收稿日期：2015年10月30日。

分类号S718.43

1)国家自然科学基金项目(C160131170510)。

责任编辑：戴芳天。