抗松针褐斑病湿地松体细胞胚胎发生与植株再生1)

张彩云　朱丽华　谈家金　陈婷婷　潘珺　梁芬　叶建仁

(南京林业大学，南京，210037)



抗松针褐斑病湿地松体细胞胚胎发生与植株再生1)

张彩云朱丽华谈家金陈婷婷潘珺梁芬叶建仁

(南京林业大学，南京，210037)

摘要为将抗松针褐斑病湿地松(PinuselliottiiEngelm.)良种快速推广，以未成熟合子胚为外植体，研究了合子胚发育阶段对胚性愈伤组织诱导以及ABA与PEG8000对体细胞胚成熟的影响，并探讨了体细胞胚质量及干化条件对体细胞胚萌发的影响。结果表明：发育至2～4阶段的合子胚最利于胚性愈伤组织的诱导，LP+16 mg·L-1ABA+180 g·L-1PEG8000+2 g·L-1AC适合于体细胞胚的成熟，高质量体细胞胚经“滤纸容器法”干化2周后萌发，萌发的体细胞胚于1/4WPM+0.3 mg·L-1NAA+1 mg·L-1IBA上培养70 d左右根部发育，转入1/2WPM中，30 d左右侧根产生发育完整的再生植株。

关键词抗性湿地松；未成熟合子胚；体细胞胚胎发生；植株再生

湿地松原产美国东南部，我国于20世纪30年代引种，由于其适应性强、早期生长快、松脂产量高等优点，已成为我国南方主要造林树种之一。然而，自1978年我国首次发现松针褐斑病(Lecanostictaacicola)以来，该病害使湿地松在我国的发展受到较大影响[1]。系统研究认为，抗病单株选择是防治该病害较有前途的方法[2]。自1982年开始，叶建仁等[3-4]从重感病林分中筛选抗病优树建立了抗病种植园。但抗病种子产量有限，且无性繁殖困难，很难在较短时间内实现规模化、产业化，阻碍了抗病良种的推广和应用。

植物体细胞胚胎发生(Somatic embryogenesis)是指体细胞在特定条件下，未经性细胞融合而通过与合子胚发生类似的途径发育出新个体的形态发生过程[5]，具有数量多、速度快、结构完整、再生率高等优点[6]。对于生长周期较长的松属树种而言，体细胞胚胎发生途径可形成产量高、稳定性强、性状均匀的再生植株，是最有希望大规模快速繁殖林木优良无性系的组培快繁技术[7-8]。目前关于湿地松体细胞胚胎发生研究报道较多。Jain et al.[9-10]首次进行了湿地松未成熟合子胚的离体培养，诱导出胚性愈伤组织并获得早期体细胞胚。1995年，Liao et al.[11-12]获得了湿地松体细胞胚胎再生植株，但植株再生率极低。1997年唐巍等[13]亦获得湿地松体细胞胚再生植株，植株转化率为15.6%。本课题组自2003年开始进行湿地松体细胞胚胎发生研究，成功诱导出胚性愈伤组织，建立了稳定的胚性细胞系，但仅获得少量再生植株。吴丽君等[14]对湿地松体细胞胚胎发生进行了较为系统的研究，目前仅获得成熟子叶胚。已有研究结果表明，湿地松体细胞胚胎发生目前尚存在胚性愈伤组织诱导率低、体细胞胚胎成熟困难和萌发率低等问题。

本文以抗松针褐斑病湿地松(以下简称抗性湿地松)未成熟合子胚为外植体，研究了合子胚发育阶段对胚性愈伤组织诱导、以及ABA与PEG8000对体细胞胚成熟的影响，并探讨了体细胞胚质量和干化条件对萌发的影响，建立了抗性湿地松体细胞胚胎发生再生体系，旨在为抗性湿地松良种的推广应用提供技术支持。

1材料与方法

1.1外植体材料的获取与处理

2014年6—7月，采取定点定株分批采集(每周1次)的方法，于福建华安西坡国有林场12年生湿地松抗病种子园进行未成熟球果采集，共涉及7#、13#、14#、16#、27#5个家系。采集的球果放冰箱中4 ℃保存。1周后，参照李清清等[15]的方法进行种子剥取及消毒处理，获得无菌雌配子体。

1.2抗性湿地松合子胚发育阶段观察

为研究抗性湿地松胚性愈伤组织诱导率与合子胚发育阶段的相关性，对6个采集期所采集球果的合子胚发育阶段进行检测。每个家系、每个采集期随机抽取3个球果，每个球果剥取5个未成熟种子，在体视镜(Leica MZ16)下观察合子胚的发育阶段并拍照。参照Pullman[16]火炬松合子胚发育阶段划分标准判断不同家系、不同采集期合子胚的发育阶段。

1.3抗性湿地松胚性愈伤组织的诱导

将不同批次采集的未成熟合子胚接种于LP+2 mg·L-12,4-D+16 mg·L-1ABA+2.5 mg·L-1KT+30 g·L-1麦芽糖+6.5 g·L-1琼脂(北京鼎国盛昌生物技术有限公司)培养基上。每处理接种20个外植体，重复3次，30 d后统计胚性愈伤组织诱导状况。胚性愈伤组织诱导率=(胚性愈伤组织数量/接种外植体数量)×100%。

1.4抗性湿地松胚性愈伤组织的增殖及其细胞结构观察

将诱导产生的胚性愈伤组织转移至增殖培养基(诱导培养基激素和糖减半)上进行增殖培养。每15 d夹取直径约6～8 mm胚性胚柄细胞团(Embryogenic Suspenser Mass-ESM)于新鲜增殖培养基上进行培养。取增殖阶段的胚性材料，经醋酸杨红—伊文斯蓝染色，于蔡司体视镜(SteREO Discovery.V20)下进行细胞学观察。

1.5抗性湿地松体细胞胚的培养方法

以7#-15为试验材料，经7个月增殖培养，选取状态良好的ESM转入以LP为基本培养基，添加ABA质量浓度4、8、16、32 g·L-1，PEG8000质量浓度150、170、180、190、210 g·L-1，植物凝胶3 g·L-1的成熟培养基上，60 d后观察体细胞胚的成熟状况。

每块愈伤组织(直径10 mm)形成体细胞胚数量=体细胞胚数量/愈伤组织数量。

1.6抗性湿地松体细胞胚的萌发

比较了完全干化与半干化(脱脂棉法和滤纸容器法)处理对体细胞胚胎萌发的影响。完全干化指将发育状态良好的成熟体细胞胚放入空培养皿中。半干化处理中，脱脂棉法指将成熟体细胞胚置于5 mm厚的脱脂棉上，再将脱脂棉放入培养皿中，每皿加无菌水；滤纸容器法则将成熟体细胞胚放置于垫有1层滤纸的培养皿(直径9 cm)中，再将该培养皿置于更大的培养皿(直径13 cm)内，大培养皿中加无菌水。

经滤纸容器法干化2周后，选取长度(2～3、3～4、4～5 mm)、直径(0～1.0、1.0～1.5、1.5～2.0 mm)和子叶个数(2、3、4、5、6个以上)不同的成熟胚分别接种于1/2GD[11-13]培养基中，比较成熟胚质量对萌发的影响。

以上萌发试验每处理20个外植体，重复3次，2周后统计体细胞胚萌发状况。萌发率=(萌发体细胞胚数量/接种体细胞胚数量)×100%。其中，萌发体胚个数包括胚轴与子叶伸长的体细胞胚数量，以及胚轴、子叶与根共同伸长的体细胞胚数量。

1.7抗性湿地松体细胞胚植株再生

体细胞胚萌发2周后将其转入1/4WPM+0.15 mg·L-1NAA+1 mg·L-1IBA+10 g·L-1蔗糖+0.1 g·L-1肌醇培养基中使其生根，光照培养70 d后统计再生植株数量。

1.8培养条件

除非特别说明，以上所有培养基中均添加3.4 mg·L-1硝酸银，5 mg·L-1抗坏血酸，1 g·L-1肌醇，450 mg·L-1谷氨酰胺(Glu)，500 mg·L-1水解酪蛋白(CH)，250 mg·L-1的2-(N-吗啡啉)，乙磺酸(MES)，pH=5.8。

愈伤组织的诱导、增殖、成熟和干化处理均为暗培养；体细胞胚萌发与植株再生培养每日光照16 h，培养温度(23±1)℃。

数据处理采用Excel。

2结果与分析

2.1抗性湿地松合子胚的发育

根据Pullman[16]的火炬松合子胚发育阶段划分标准，将抗病湿地松合子胚的发育划分为8阶段(图1)。第1阶段合子胚丝状透明，可见明显胚头(图1A)；第2阶段合子胚透明，多个胚在增殖和发育，为裂生多胚阶段(图1B)；第3阶段一个合子胚的胚头明显伸长，其余胚头开始退化，胚柄也明显缩短、变粗，胚头逐渐变为白色，不透明(图1C)；第4阶段胚头乳白色，不透明；开始发育为圆筒状(图1D)；第5阶段合子胚胚头顶端可见突起的顶端分生组织，形似子弹头，也成子弹头阶段(图1E)；第6阶段合子胚胚头顶端子叶组织发育，可见突起的子叶(图1F)；第7阶段合子胚胚头子叶组织发育(图1G)；第8阶段子叶继续伸长，弯曲开始张开(图1H)。对5个家系6个采集期的合子胚进行随机抽样检测，检测结果表明同一时期不同家系合子胚发育阶段有一定的差异，同一球果不同部位的合子胚发育阶段也有一定的差异。这可能与当年的气候、球果授粉时间，以及接受光照条件不同有关。不同采集期未成熟合子胚的形态特征同样有所差异。

A为第1阶段；B为第2阶段；C为第3阶段；D为第4阶段；E为第5阶段；F为第6阶段；G为第7阶段；H为第8阶段。

2.2抗性湿地松合子胚发育阶段与胚性愈伤组织诱导率的关系

将雌配子体放入诱导培养基2周后，雌配子体膨胀，部分外植体珠孔端产生白色半透明的胚性愈伤组织(图2A)。合子胚发育阶段对胚性愈伤组织诱导有着至关重要的作用。从表1可知，除了家系27#在6月25日合子胚发育1～3阶段诱导率最高外，其余3个家系在7月2日即合子胚发育的第2～4阶段(即多胚阶段)诱导率较高，其中7#、13#、16#、27#胚性愈伤组织诱导率均达到5%以上，且胚性愈伤组织状态良好。随着合子胚发育逐渐成熟，胚性愈伤组织诱导率也逐渐下降；发育后期的合子胚未能诱导出胚性愈伤组织。因此，对于大多数家系而言，发育至2～4阶段的合子胚为胚性愈伤组织诱导的适合外植体。

表1合子胚发育阶段与不同家系抗性湿地松胚性愈伤组织诱导的相关性

发育阶段采集日期诱导率/%7#13#14#16#27#1～36月25日2.264.2602.1410.092～47月2日5.565.4805.336.172～57月9日5.041.5901.672.353～57月16日2.830001.044～87月23日01.010005～97月30日00000

2.3胚性愈伤组织的增殖培养

诱导出的ESM直径约5～81 mm时，转移至增殖培养基上培养(图2B)。经4次继代后，在所转接继代的69个细胞系中，仅7#-1、7#-2、7#-11、7#-15、13#-1、27#-2和27#-5,7个细胞系进入稳定增殖状态，其余的或增殖缓慢，或褐化死亡。取少量增殖状态良好的胚性愈伤组织用醋酸洋红和伊文思蓝双染色法进行细胞学观察，ESM由长的胚柄细胞和圆的胚性细胞组成，通常胚性细胞被醋酸洋红溶液染成红色，胚柄细胞被伊文思蓝溶液染成蓝色(图2C)。

2.4抗性湿地松体细胞胚的成熟培养

将增殖状态良好的ESM，分别转入含有不同质量浓度的ABA、PEG8000及活性炭的成熟培养基上，30 d左右在胚性愈伤组织上可观察到明显的胚头产生(图2D)，60 d后可见子叶张开的体细胞胚(图2E)。ABA和PEG质量浓度对体细胞胚形成有较大影响。由表2可知，ABA为16 mg·L-1时每块愈伤组织上获得的成熟子叶胚最多，ABA过高或较低形成的体细胞胚数量较少，质量也降低。PEG8000质量浓度为150 g·L-1时每块愈伤组织上只有少量成熟体细胞胚形成；随着PEG的升高，成熟胚数量增加，PEG8000质量浓度为170～190 g·L-1每块可获得15个左右的成熟体细胞胚，高于190 g·L-1后随着PEG质量浓度增加，子叶胚数量逐渐减少。因此，16 mg·L-1ABA+180 g·L-1PEG8000最利于体细胞胚的分化。在该质量浓度组合下，长度在3～4 mm的体细胞胚居多，利于后期体胚的萌发与植株再生。

2.5干化处理对抗性湿地松体细胞胚萌发的影响

干化处理对体细胞胚萌发有很大影响(表3)，未经干化处理的体细胞胚发育畸形率达64%，萌发率仅10%；完全干化的体胚由于失水严重大部分变硬，转至萌发培养基上不发育，萌发率为8%；半干化处理中“滤纸容器法”更利于体胚达到生理成熟和后期的萌发，萌发率达71%；“脱脂棉法”由于湿度不好控制，体胚一半发育畸形，同时由于干化过程中体胚发育伸长在夹取时，脱脂棉会缠绕在体胚上，影响操作和体胚完整。

表2　ABA和PEG8000对体细胞胚成熟的影响

表3　不同干化处理后体细胞胚表现及对萌发的影响

2.6体细胞胚的质量对萌发的影响

试验结果表明，体细胞胚的质量对其后期萌发有很大影响。直径1.0～1.5 mm、长3.0～4.0 mm的体细胞胚萌发率最高，畸形苗与死亡率最低，体细胞胚长度越短、直径越小越不易萌发，但过长(过大)畸形苗的概率升高(表4)；体细胞胚的子叶数量也对体胚萌发有一定的影响，具3～5个子叶的成熟胚萌发率最高，也不易产生畸形苗；子叶多于6个时多产生肿大，胚轴不能伸长的畸形苗；子叶少于3个的体胚多不发育且死亡率较高。体细胞胚长度在3.0～4.0 mm，平均直径在1.5～2.0 mm，子叶个数在3～5个时，体胚萌发能力最强，萌发率最高。

表4　体细胞胚胎质量对体细胞胚萌发的影响

不同体胚宽度成熟子叶胚萌发率/%>1.0～1.5mm>1.5～2.0mm不同体胚宽度成熟子叶胚畸形率/%>1.0～1.5mm>1.5～2.0mm不同体胚宽度成熟子叶胚死亡率/%>1.0～1.5mm>1.5～2.0mm7240834816

不同子叶数量成熟子叶胚萌发率/%2个3个4个5个6个以上不同子叶数量成熟子叶胚畸形率/%2个3个4个5个6个以上不同子叶数量成熟子叶胚死亡率/%2个3个4个5个6个以上1872766610301064603812102218

注：成熟子叶胚外植体数量为60个。

2.7植株再生

经过2周萌发培养后，仅有少部分体细胞胚在萌发过程根部发育；大部分体细胞胚胚轴伸长，子叶逐渐张开，但根部未能发育(图2F)。将根部未发育的体胚转入1/4WPM+0.15 mg·L-1NAA+1 mg·L-1IBA培养基中诱导生根，70 d后，70%的体细胞胚胚根端长出白色根尖(图2G),将产生根尖的体胚苗转入1/2WPM中，30 d左右，侧根产生，形成完整植株。

3结论与讨论

胚性愈伤组织的获得是体细胞胚胎发生的关键，以针叶树未成熟的合子胚为材料可以显著提高胚性愈伤组织的诱导率。Tautorus et al.[17]报道黑云杉未成熟合子胚胚性愈伤组织诱导率比贮藏13 a的成熟合子胚高57%；吕守芳等[18]以日本落叶松(Larixkaempferi)未成熟胚、成熟胚、胚根和胚轴等为外植体进行体胚研究时发现，只有未成熟合子胚能够诱导出胚性愈伤组织;吴丽君等[19]认为火炬松(Pinustaeda)2～4阶段的合子胚是胚性愈伤组织诱导的最佳外植体。赤松[20]、落叶松[21]和兴安落叶松[22]等树种体细胞胚胎发生中也有类似结果。本试验亦证明湿地松2～4阶段合子胚胚性愈伤组织诱导率最高，随着合子胚逐渐发育成熟，胚性愈伤组织的诱导率急剧降低。

A.诱导2周后珠孔端产生的胚性愈伤组织;B.胚性愈伤组织的增殖;C.经醋酸洋与伊文思蓝染色后的ESM;D.LP+16 mg·L-1ABA+180 g·L-1PEG8000培养基上30 d后形成体细胞胚;E.成熟培养60 d后的体细胞胚;F.体细胞胚的萌发;G-H.完整的体细胞胚植株。

图2抗性湿地松体细胞胚胎发生过程

影响针叶树胚性愈伤组织分化产生体细胞胚的因素很多，如培养基渗透压、激素种类和质量浓度、基因型等，其中脱落酸(ABA)是最为关键的因素。ABA的主要作用是促进体细胞胚成熟，防止畸形胚及裂生多胚的产生，而且有利于提高体细胞胚的质量，对抑制体细胞胚提前萌发也有重要作用[23]。大量研究表明ABA在分化过程中和聚乙二醇(PEG)联合使用，可以显著促进针叶树体细胞胚的成熟[24]。PEG作为一种重要的渗透调节物质，能够调节培养基的渗透压，使待分化细胞处于相对适中的渗透环境中，从而有利于体细胞胚的分化。ABA与PEG质量浓度不同对体胚成熟的影响不同。Pullman等[23]研究表明，5 mg·L-1ABA与13% PEG组合可获得最多体细胞胚，且其质量最高。当ABA浓度为30 μmol/L时湿地松成熟体细胞胚数量最多且质量也最好[12]。唐巍[13]和吴丽君[14]等在湿地松体胚发生研究中得出的最佳分化质量浓度分别为4 mg·L-1ABA+0.75% PEG和70 mg·L-1ABA+150 g·L-1PEG 8000。本试验中体细胞胚分化成熟的最适宜质量浓度组合为16 mg·L-1ABA+180 g·L-1PEG 8000。不同试验所得出的结果不尽相同，可能与树种、产地、基因型、树龄、试剂使用方式等诸多因素有关。

在体细胞胚胎发生过程中，体细胞胚的大量正常萌发，是实现体胚苗工厂化生产的关键。适当的干化处理可以促使体细胞胚由形态成熟向生理成熟转变，提高体细胞胚的萌发率和质量[25]。Harry等[26]对红云杉体细胞胚分别干化处理3和6 d后，体细胞胚的萌发率分别为94%和85%，而对照只有48%。张建伟[27]在研究粗枝云杉体胚萌发前的干化调控机制中发现，未干化处理和干化处理2周后体胚萌发率分别为4.67%和56.83%。本试验中，未经干化处理的体细胞胚萌发率极低或不能正常萌发，适当的干化处理极显著地促进了体细胞胚的萌发，体细胞的萌发率由10%提到到71%。因此，体细胞胚萌发前进行适当干化处理对其后期萌发至关重要。

体细胞胚的质量直接影响体细胞胚的萌发。高质量的黑松体胚能提高体胚的萌发率和植株转化率[15]。本试验发现当成熟子叶胚长度在3.0～4.0 mm，直径在1.5～2.0 mm，子叶数在3～5个的体胚萌发能力最好，萌发率最高。本研究获得的成熟体胚子叶数大多数在3～5个，但湿地松实生苗的子叶个数一般在6～9个，体胚苗后期生长是否存在差异，需要后期继续研究。

体细胞胚萌发与植株再生条件的调节有利于提高体细胞胚的产量和植株再生率。齐力旺等[28]在萌发培养基中附加低质量浓度的IBA和NAA明显促进华北落叶松(Larixprincipis-rupprechtii)体细胞胚根的发生。本试验中，植株再生培养基添加1 mg·L-1IBA和0.3 mg·L-1NAA有利于促进根的发生和子叶伸长。

综上，本研究以抗性湿地松未成熟合子胚为外植体，通过诱导获得了优质胚性愈伤组织，成功建立了湿地松体细胞胚成熟、萌发与植株再生体系，获得了完整的再生植株，为抗性湿地松良种的推广打下基础。

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Somatic Embryogenesis and Plantlet Regeneration of Disease-resistant Slash Pine (PinuselliottiiEngelm.) to Brown Spot Needle Blight

Zhang Caiyun, Zhu Lihua, Tan Jiajin, Chen Tingting, Pan Jun, Liang Fen, Ye Jianren

(Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(6)：17-22.

In order to accelerate the propagation of slash pine (PinuselliottiiEngelm.) resistant to brown spot needle blight caused byLecanostictaacicola, we studied the effects of development of zygotic embryo on embryocenic tissue initiation as well as the effects of ABA and PEG8000 on the maturation of somatic embryos by using the immature zygotic embryos as explants. We also discussed the impact of quality of somatic embryo and drying approaches on germination of somatic embryo. The immature zygotic embryos developed at Stage 2-4 were optimal for induction of embryonic callus. The LP medium supplemented with 16 mg·L-1ABA+180 g·L-1PEG8000+2 g·L-1activated charcoal benefited for maturation of somatic embryos. Somatic embroy germination was accomplished by a partial desiccation treatment (paper vessel method) for two weeks by using high quality somatic embryos. The root development after 70 days on 1/4WPM medium supplemented with 0.3 mg·L-1NAA+1 mg·L-1. The germinated somatic embryos developed into whole plants after 30 d in 1/2WPM.

KeywordsDisease-resistant slash pine; Immature zygotic embryos; Somatic embryogenesis; Plant regeneration

第一作者简介：张彩云，女，1990年5月，南京林业大学林学院， 硕士研究生。E-mail:1039417962@qq.com。 通信作者：谈家金，南京林业大学林学院，教授。E-mail:tanjiajin@tom.com。

收稿日期：2015年10月28日。

分类号S76

1)国家“十二五”科技支撑项目(2012-2016)(2012BAD19B0703)；江苏省生物学和林学优势学科项目(PAPD)。

责任编辑：潘华。