干预肾素-血管紧张素-醛固酮系统不同环节对单侧输尿管梗阻大鼠肾组织的影响*

韩晓庆　孙建平　李娜　崔萌　张宁　刘逸凡



干预肾素-血管紧张素-醛固酮系统不同环节对单侧输尿管梗阻大鼠肾组织的影响*

韩晓庆①孙建平①李娜②崔萌①张宁①刘逸凡①

【摘要】目的：观察干预肾素-血管紧张素-醛固酮系统不同环节对单侧输尿管梗阻大鼠肾组织的影响。方法：选取6周龄SD大鼠50只作为研究对象，随机分为正常组、模型组、依那普利组、缬沙坦组及螺内酯组，每组10只。采用单侧输尿管梗阻（UUO）大鼠模型，正常组和模型组于造模前24h-造模后14d给予0.9%氯化钠溶液10mL/（kg·d）灌胃，依那普利组、缬沙坦组及螺内酯组分别于造模前24h-造模后14d给予依那普利10mg/（kg·d）、缬沙坦10mg/（kg·d）、螺内酯100mg/（kg·d）灌胃。各组大鼠均于造模后2周处死，收集血、尿标本进行生化检测，肾组织行HE染色及逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法观察梗阻肾组织TGF-β1mRNA、血管紧张素原（AGT）mRNA、血管紧张素转化酶（ACE）mRNA、醛固酮（ALD）mRNA的表达。结果：与正常组比较，模型组、依那普利组、缬沙坦组及螺内酯组的血肌酐、尿素氮均不同程度增高，以模型组升高最为明显，比较差异均有统计学意义（P＜0.05），依那普利组、缬沙坦组及螺内酯组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）；五组间24h尿蛋白比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；依那普利组、缬沙坦组及螺内酯组肾间质损伤指数均高于正常组，但低于模型组，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论：阻断肾素-血管紧张素-醛固酮系统不同环节均具有抑制大鼠肾间质纤维化的作用，且其效果相近。

【关键词】肾间质纤维化；肾素-血管紧张素-醛固酮系统；大鼠

①青岛大学附属医院山东青岛266003

②山东省青岛市第八人民医院

First-author’s address：The Affiliated Hospital of Qingdao University，Qingdao 266003，China

肾间质纤维化是由肾间质成纤维细胞增殖和细胞外基质在肾间质内过度沉积所导致，是慢性肾脏病发展的最终结果，是导致终末期肾功能衰竭的主要原因之一。肾功能的恶化，主要取决于肾小管间质纤维化的程度［1］。研究表明，肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosteronesystem，RAAS）尤其是血管紧张素Ⅱ（AngⅡ），不仅在调节血流动力学而且在肾间质纤维化中起重要作用［2］。大量实验表明，ACEI、ARB及醛固酮拮抗剂均可延缓肾间质纤维化的进展，然而这三类药物抗肾间质纤维化的疗效是否相近或其中某类药物抗肾间质纤维化的效果更显著目前还未见报道［3-5］。本实验应用依那普利、缬沙坦及螺内酯分别阻断RAAS不同环节，观察其抗肾间质纤维化的作用，现报道如下。

1　材料与方法

1.1实验动物6周龄健康雄性SD大鼠50只，体重160～200g，清洁级。

1.2药物与试剂马来酸依那普利（扬子江药业集团江苏制药股份有限公司，批号：国药准字H32026568），缬沙坦（北京诺华制药有限公司，批号：国药准字H20040217），螺内酯（海南海神同洲制药有限公司，批号：国药准字H46020690）。TRIzol（lifetechnologies），FastQuantcDNA第一链合成试剂盒（北京天根），SuperReal荧光定量预混试剂（北京天根）。

1.3方法

1.3.1分组和建模50只健康雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、依那普利组、缬沙坦组和螺内酯组，每组10只。模型组、依那普利组、缬沙坦组及螺内酯组大鼠用10%水合氯醛（3mL/kg）腹腔注射麻醉，仰卧位固定，75%乙醇消毒，腹部正中左侧纵行切口，分离左侧输尿管，于中上1/3处结扎并剪断输尿管，使左侧肾脏完全梗阻，逐层缝合，正常组大鼠打开腹腔后只分离但不结扎和剪断输尿管。术后腹腔注射青霉素（10U/d，连续3d），造模前24h-造模后14d，依那普利组用血管紧张素转化酶抑制剂依那普利10mg/（kg·d），缬沙坦组用血管紧张素Ⅱ的Ⅰ型受体拮抗剂缬沙坦10mg/（kg·d），螺内酯组用醛固酮受体拮抗剂螺内酯100mg/（kg·d）灌胃，正常组和模型组用2mL/d0.9%氯化钠溶液灌胃。

1.3.2肾组织标本采集造模后14d处死所有大鼠，快速取出左肾，去除包膜，用0.9%氯化钠溶液将左肾积存的血液冲洗干净，按冠状位纵行剖开，一半肾组织置于4%甲醛固定液固定，用于HE染色；另一半肾组织快速置于-80℃低温冰箱保存，用于RT-PCR［6］。

1.3.3肾功能指标检测造模后13d（处死前1d），将大鼠置于代谢笼，留取大鼠24h尿液，送检验科检测24h尿蛋白定量。造模后14d处死所有大鼠，经腹主动脉采血5mL，室温静置1h，3000r/min，4℃离心15min，取上层血清检测血清Scr、BUN。

1.3.4肾组织病理检查肾组织标本用4%甲醛固定液固定，常规脱水，石蜡包埋，切片4μm，行HE染色，光镜观察肾小球、肾小管的病理变化及炎症细胞浸润的情况。按肾间质损伤8项指标评分：肾小管上皮细胞空泡变性、肾小管扩张、肾小管萎缩、红细胞管型、蛋白管型、间质水肿、间质纤维化、间质细胞浸润，计算其均值，作为该标本的肾小管间质损伤指数［7］。

1.3.5肾组织TGF-β1、AGT、ACE、ALDmRNA检测采用RT-PCR法，TRIzol提取肾组织总RNA，按TRIzol说明书步骤提取。用FastQuant cDNA第一链合成试剂盒合成cDNA，取4μL cDNA为模板按PCR试剂盒说明进行PCR扩增，总体系为20μL，以GAPDH为内参，引物及内参序列由上海生工设计及合成。引物序列：TGF-β1：上游5’CTTTGTACAGCACCCGC3’，下游5’TAGATTGCGTTGCGGTC3’；AGT：上游5’CTGGAGCTAAAGGACACACAGA3’，下游5’GTGGATGTATACGCGGTCCC3’；ACE：上游5’GCTTGACCCTGGATTGCAGC3’，下游5’CTCCGTGATGTTGGTGTCGT3’；ALD：上游5’GAAGTTCGATCTGGGGCCAA3’，下游5’AGGGTCATATAGGGTCGCTGA3’；GAPDH：上游5’GGCAAGTTCAACGGCACAGT3’，下游5’AAGACGCCAGTAGACTCCACG3’。

1.4统计学处理采用SPSS19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（±s）表示，比较采用t检验，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组肾功能指标检测结果比较各组大鼠24h尿蛋白比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；模型组、依那普利组、缬沙坦组及螺内酯组肌酐、尿素氮均较正常组升高，其中模型组升高最为明显，依那普利组、缬沙坦组及螺内酯组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1　各组大鼠肾功能指标检测结果（±s）

表1　各组大鼠肾功能指标检测结果（±s）

*与正常组比较，P＜0.05；△与模型组比较，P＜0.05

组别　24　h尿蛋白（mg/d）肌酐（μmol/L）尿素氮（mmol/L）正常组（n=10）　12.39±8.23　63.33±5.79　　　8.54±1.46模型组（n=10）　　9.28±5.01　75.00±5.18*　11.32±0.68*依那普利组（n=10）　8.62±5.60　70.20±2.49*△　10.14±1.19*△缬沙坦组（n=10） 17.14±8.95　70.17±1.72*△　　　9.93±0.72*△螺内酯组（n=10） 14.65±8.68　68.00±3.06*△　　　9.91±1.03*△

2.2各组肾脏组织病理改变结果比较光镜显示正常组大鼠肾小球、肾小管及间质大小或形态结构均正常；模型组肾间质大量炎症细胞浸润，间质间隙增宽，细胞外基质成分增多，并可见肾小管上皮细胞水肿、变性、坏死，管腔内可见脱落坏死的上皮细胞，肾小管扩张；依那普利、缬沙坦及螺内酯组上述病理改变明显减轻，见图1。与正常组的肾间质损伤指数（1.67±0.58）比较，模型组（6.00±1.00）、依那普利组（3.67±0.58）、缬沙坦组（4.00±1.00）及螺内酯组（3.66±1.15）均有不同程度地升高，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，依那普利组、缬沙坦组及螺内酯组肾间质损伤指数均不同程度地降低，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。

图1　肾脏病理HE染色（×200）注:A正常组；B模型组；C依那普利组；D缬沙坦组；E螺内酯组

2.3各组大鼠TGF-β1mRNA、AGTmRNA、ACE mRNA、ALDmRNA的表达结果RT-PCR结果显示，输尿管结扎后大鼠肾脏TGF-β1mRNA、AGTmRNA、ACEmRNA及ALDmRNA表达均较正常组有不同程度地增加。依那普利组、缬沙坦组及螺内酯组TGF-β1mRNA、AGTmRNA、ACE mRNA、ALDmRNA的表达较模型组大鼠明显减少（P＜0.05），但三组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），见图2。

图2　各组大鼠TGF-β1mRNA、AGT mRNA、ACE mRNA及ALD mRNA的表达

3　讨论

肾间质纤维化是以肾小管萎缩或扩张，肾间质炎性细胞浸润，成纤维细胞形成与积聚及细胞外基质在肾间质中过度沉积为特征的不可逆的发展过程［8］。肾间质的病变程度是决定10年肾脏存活率最重要的影响因素，对肾脏疾病预后的影响较肾小球病变更为重要［9］。UUO模型是以进行性肾间质纤维化为特征的实验性肾病模型，持续输尿管梗阻引起的慢性炎症和间质纤维化可导致肾功能的进行性丧失［10］。

目前研究认为，肾间质纤维化是各种细胞、细胞因子及炎症因子相互作用，导致细胞外基质代谢失衡，在肾间质异常集聚所致，其中转化生长因子β1（transforminggrowthfactorβ1，TGF-β1）是促进细胞增殖和间质纤维化的重要因子［11］。大量的动物实验和临床研究表明，肾小管上皮细胞、成纤维细胞及系膜细胞等肾脏固有细胞TGF-β1表达上调通常与肾间质纤维化密切相关。作为一种强效的致纤维化因子，TGF-β1在肾间质纤维化的发生发展中起重要作用。TGF-β1主要的致纤维化作用表现在：（1）可趋化炎症细胞在肾间质浸润，促使肾小管上皮细胞转化为成纤维细胞，进而产生大量的细胞外基质；（2）抑制多种细胞外基质降解酶的活性，促进金属蛋白酶组织抑制因子-l及纤溶酶原激活抑制因子-1的表达，抑制细胞外基质的降解；（3）增加ECM的受体如整合素的表达，从而增加ECM与细胞的相互作用［12-14］。本实验结果显示，模型组、依那普利组、缬沙坦组及螺内酯组的TGF-β1表达较正常组明显增加，但依那普利组、缬沙坦组及螺内酯组的TGF-β1表达较模型组又明显降低，表明TGF-β1在肾间质纤维化的过程中起促进作用，且依那普利（ACEI）、缬沙坦（ARB）及螺内酯（醛固酮拮抗剂）对肾间质纤维化有一定的防治作用。

肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）是人体内重要的体液调节系统，RAAS除了存在于循环系统中，还存在于许多组织器官中，如心脏、肾脏、肾上腺等，称为局部RAAS，其主要与组织纤维化和/或重构过程有关。研究表明，随着肾脏的受损，可观察到RAAS的成分如血管紧张素原、血管紧张素转换酶、血管紧张素I和血管紧张素Ⅱ的上调或重新分布。肾脏局部RAAS在肾间质纤维化的形成中具有重要的促进作用，其效应分子血管紧张素Ⅱ（Ang-Ⅱ）和醛固酮是重要的致炎因子，可促进成纤维细胞增殖和细胞外基质的合成，促进肾间质纤维化［15］。AngⅡ是RAAS的主要生物活性成分，是一种重要的细胞因子，具有多重生理学效应，可通过诱导细胞因子、生长因子和黏附分子等的表达发挥其促纤维化作用［16］。有研究表明，AngⅡ可激活肾小管上皮细胞及成纤维细胞，促进TGF-β1的合成和释放，致使肾间质细胞外基质成分的过度产生［17-18］。血管紧张素转化酶抑制剂（依那普利）能有效抑制AngⅡ的合成，减少体内AngⅡ的含量，从而减轻肾间质纤维化的程度［19］。血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（缬沙坦）有效地阻断AngⅡ与其受体（AT1）相结合，亦可达到减轻肾间质纤维化的效果。近几年的研究显示，醛固酮不仅可以致水钠潴留，而且可以促进组织胶原沉积和纤维化，是肾间质纤维化过程中的一个重要因素，在进展性肾脏损害中发挥重要的作用。有研究表明，醛固酮是有丝分裂和胶原合成的强烈刺激剂，可以促进肾脏纤维化［20］。本研究结果表明，与模型组比较，依那普利组、缬沙坦组、螺内酯组TGF-β1表达明显下调，肾功能明显好转，肾损伤指数明显降低，表明依那普利、缬沙坦、螺内酯对肾间质纤维化具有负性调节作用，通过下调TGF-β1的表达，减少细胞外基质的沉积，阻止肾间质纤维化的进展，延缓肾功能的恶化。

综上所述，TGF-β1表达增多与肾间质纤维化密切相关。依那普利、缬沙坦、螺内酯均可通过下调TGF-β1表达而减轻肾间质纤维化程度，延缓肾功能恶化，但三组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），说明其抗肾间质纤维化的作用效果相近。

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Effect of Different Aspects of the Intervention of the Renin Angiotensin Aldosterone System on Renal Tissue of Rats with Unilateral Ureteral Obstruction

HAN Xiao-qing，SUN J ian-ping，LI Na，et al.
Medical Innovation of China，2016，13（13）：001-005

【Abstract】Objective：Toobservetheeffectsofdifferentaspectsoftheinterventionofthereninangiotensin aldosteronesystemontherenaltissueofratswithunilateralureteralobstruction.Method：Atotalof50SDrats whichwas6weeksoldwereselectedastheresearchobjects，theywererandomlydividedintothenormalgroup，modelgroup，Enalaprilgroup，ValsartangroupandSpironolactonegroup，eachgrouphad10rats.Therat modelofunilateralureteralobstruction（UUO）wasused，thenormalgroupandmodelgroupweregivensaline10 mL/（kg·d）0.9%SodiumChlorideSolutionbefore24hformodelingto14daftermodeling；Enalaprilgroup，ValsartangroupandSpironolactonegroup24hformodelingto14daftermodelingwererespectivelytreated withEnalapril10mg/（kg·d），Valsartan10mg/（kg·d），Spironolactone100mg/（kg·d），ratsineach groupweresacrificedat2weeksaftermodeling，bloodandurinesampleswerecollectedforbiochemicaltests，theobstructiverenaltissuesTGF-β1mRNA，angiotensinogen（AGT）mRNA，vasculartensionangiotensin convertingenzyme（ACE）mRNAandaldosterone（ALD）mRNAexpressionwereobservedaccordingrenal tissueforHEstainingandreversetranscriptasepolymerasechainreaction（RT-PCR）method.Result：Compared withnormalgroup，theserumcreatinineandureanitrogenwereincreasedinthemodelgroup，enalaprilgroup，ValsartangroupandSpironolactonegroup，modelgroupincreasedmostsignificantly，thedifferenceswere statisticallysignificant（P＜0.05），therewerenostatisticallysignificantdifferencesintheEnalaprilgroup，ValsartangroupandSpironolactonegroup（P＞0.05）.Therewerenosignificantdifferencesinfivegroupsof24h urineprotein（P＞0.05）.TherenalinterstitialinjuryindexofEnalaprilgroup，valsartangroupandSpironolactone groupwerehigherthannormalgroup，butlowerthanmodelgroup，thedifferenceswerestatisticallysignificant（P＜0.05）.Conclusion：Blockadeoftherennin-angiotensin-aldosteronesystematdifferentlevelscouldinhibit renalinterstitialfibrosisinratsandtheeffectissimilar.

【Key words】Renalinterstitialfibrosis；Renin-angiotention-aldosteronesystem；Rat

*基金项目：国家自然科学基金面上项目（81170653）

通信作者：孙建平

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.13.001

收稿日期：（2016-01-14）（本文编辑：李颖）