氨肽酶N在乳腺癌中的表达及与MMP-2、MMP-9的相关性研究

冯　丽，赵玉哲，曹文庆，张　静

(河北省人民医院 普外一科，河北 石家庄 050051)



氨肽酶N在乳腺癌中的表达及与MMP-2、MMP-9的相关性研究

冯丽，赵玉哲，曹文庆，张静

(河北省人民医院 普外一科，河北 石家庄 050051)

[摘要]目的研究氨肽酶N(aminopeptidase N，APN)在乳腺癌中的表达及临床意义，并观察其与基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的关系。方法收集河北省人民医院病理科2011年7月至2012年9月乳腺癌石蜡标本60例，癌旁正常乳腺组织石蜡标本20例，及患者的临床病理资料。采用免疫组织化学SP法检测APN在80例标本中的表达，并分析APN表达与乳腺癌患者临床病理特征之间的关系。检测MMP-2、MMP-9在乳腺癌组织中的表达,及与APN表达的相关性。结果APN在乳腺癌中的阳性表达率36.7%(22/60)明显高于癌旁正常乳腺组织0%(0/20)(χ2=10.115，P=0.001)。APN在乳腺癌中的表达与肿瘤病理类型有关(P=0.035)，多表达于浸润性导管癌；与患者绝经状况、肿瘤大小、临床分期、组织学分级、淋巴结转移状态、ER、PR、Her-2等无关(P>0.05)。乳腺癌组织APN的表达与MMP-2 、MMP-9的表达无相关性(P>0.05)。结论APN在乳腺癌中的表达高于正常乳腺组织，但APN在乳腺癌中侵袭转移的机制有待进一步深入研究。

[关键词]氨肽酶N/CD13；免疫组织化学；乳腺癌；基质金属蛋白酶-2；基质金属蛋白酶-9

[引用本文]冯丽，赵玉哲，曹文庆，等.氨肽酶N在乳腺癌中的表达及与MMP-2、MMP-9的相关性研究[J].大连医科大学学报，2016,38(3)：219-223.

氨肽酶N(aminopeptidase N，APN)，又称CD13，是一种能从肽链氨基端催化降解氨基酸残基的水解蛋白酶。多年来APN/CD13主要作为髓系造血干细胞表面的标志物而应用于白血病或者淋巴瘤的分型，近年来却相继报道，其在肺癌、卵巢癌和肝癌等多种癌细胞表面高水平表达，在体内参与肿瘤的侵袭转移。Chang YW等[1]研究发现APN可以增加肺癌细胞的迁移能力和侵袭力。Inagaki Y等[2]研究显示应用APN抑制剂24F可抑制肝癌细胞的侵袭性。本实验应用免疫组织化学SP法，检测APN在乳腺癌组织中的表达情况，分析其与乳腺癌患者临床病理特征之间的关系；并通过比较APN表达与MMP-2、MMP-9的关系，探讨APN在乳腺癌侵袭转移中所起的作用。

1材料和方法

1.1临床资料

收集河北省人民医院病理科2011年7月至2012年9月经手术切除、病理证实的乳腺癌石蜡标本60例，癌旁正常乳腺组织石蜡标本20例，及其患者的临床病理资料。所有乳腺癌患者均为女性，年龄28～72岁，中位年龄51.5岁，术前均未行放疗、化疗或其他针对肿瘤的治疗，无其他肿瘤病史。

1.2试 剂

鼠抗人APN单抗(38C12)、鼠抗人MMP-2单抗(17B11)、鼠抗人MMP-9单抗(BA0573)、 SP试剂盒及DAB试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3免疫组织化学染色

所有石蜡标本切成4 μm 厚切片，采用免疫组织化学SP 法检测APN在乳腺癌及癌旁正常组织中的表达情况，同时检测MMP-2、MMP-9 在乳腺癌织中的表达。用PBS代替一抗作为阴性对照，用预实验阳性片做阳性对照。

1.4结果判定

APN主要表达定位在细胞膜上。阳性判断标准：(1)按阳性着色程度评分：0分为无着色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。(2)在高倍镜(×400)下计数400个肿瘤细胞，按阳性细胞百分比评分：<10%为1分；11%～50%为2分；51%～75%为3分；>75%为4分。两者乘积判定阳性结果：1～3分为阴性(-)；4～5分为弱阳性(+)；6～7分为中阳性(++)；≥8分为强阳性(+++)。以“-”者为阴性，以“+、++、+++”者为阳性。

MMP-2、MMP-9主要定位于细胞浆，以胞浆内呈棕褐色颗粒为阳性。阳性判断标准：(1)显色强度评分：0分为无着色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。(2)高倍镜下(×400)随机取4个视野，计算阳性细胞百分比，<10%为0分，11%～25%为1分，26%～50%为2 分，51%～75%为3 分，≥76%为4 分。两者分数相加判定阳性结果，0～1 分为阴性(-)，2～3 分为弱阳性(+)，4～5 分为中阳性(++)，6～7 分为强阳性(+++)。以“-”者为阴性，以“+、++、+++”者为阳性。

1.5统计学方法

所有数据应用SPSS 13.0统计软件处理。数据均为计数资料，采用χ2检验比较APN表达在两组间的差异，采用spearman分析APN与MMP-2、MMP-9 的相关性。以P<0.05为有统计学意义。

2结果

2.1APN在乳腺癌组织及癌旁组织中的表达

APN主要表达于乳腺癌细胞的细胞膜，少见细胞浆着色，多呈棕黄色或者浅黄色(图1)，间质细胞表达缺乏。60例乳腺癌标本中，阴性38例，弱阳性8例，中阳性5例，强阳性9例，APN在乳腺癌中的阳性表达率为36.7%(22/60)，显著高于癌旁正常乳腺组织0%(0/20)(χ2=10.115，P=0.001)(图2)。

2.2APN表达与乳腺癌患者临床病理特征之间的关系

APN的表达与肿瘤病理类型有关，多表达于浸润性导管癌(P<0.05)，与患者绝经状况、肿瘤大小、临床分期、组织学分级、淋巴结转移状态等无关(P>0.05)，与ER、PR、Her-2指标无关。见表1。

2.3MMP-2、MMP-9在乳腺癌组织中的表达及与APN的关系

MMP-2、MMP-9主要定位于细胞浆，多呈棕褐色颗粒状(图3、4)。MMP-2阳性表达率为75.0%(45/60)。MMP-2阳性组和MMP-2阴性组APN阳性表达率分别为33.3%(15/45)和46.7%(7/15)，两组差异无统计学意义(χ2=0.861，P=0.353)。MMP-9阳性表达率为76.7%(46/60)。MMP-9阳性组和MMP-9阴性组APN阳性表达率分别为39.1%(18/46)、28.6%(4/14)，两组差异无统计学意义(χ2=0.515，P=0.473)。相关性分析显示，APN与MMP-2、MMP-9均无明显相关性(rs=-0.113，P=0.390；rs=0.076，P=0.566)。

图3　乳腺癌组织中MMP-2阳性表达(SP×200)

图4　乳腺癌组织中MMP-9阳性表达(SP×200)

3讨论

人APN基因定位于第15号染色体长臂25-26区，全长35 kb，包含20个外显子。APN基因有近端和远端两个启动子，在上皮细胞中多由近端启动子启动转录；在髓细胞及成纤维细胞中，多由远端启动子启动转录。APN蛋白属于结合锌离子的金属蛋白酶超家族，由967个氨基酸组成，分子量约150 kD左右，通过N端跨膜螺旋区锚在细胞膜上[3]，能够从肽、酰胺或芳酰胺上水解释放N端的中性氨基酸。研究发现，APN在肿瘤的侵袭转移、血管生成、信号转导和免疫调节等方面都发挥着重要作用，以APN为靶点的靶向性抗肿瘤药物也成为了抗癌药物开发的新领域。

基底膜和细胞外基质降解是肿瘤侵袭转移的基础。研究发现，APN是一种与降解细胞外基质(ECM)蛋白相关的酶，这种酶在肿瘤细胞上的表达可能增强细胞运动性，加快肿瘤侵袭和转移[4]。Terauchi M等[5]发现卵巢癌细胞APN的表达水平与癌细胞迁徙力呈正相关，应用APN抑制剂bestatin，可显著抑制卵巢癌细胞的迁移能力。本研究通过免疫组化SP法研究了APN在乳腺癌中的表达情况。发现APN主要表达于肿瘤细胞，定位于细胞膜，这可能与APN定位于细胞膜的分子结构有关。APN在乳腺癌中表达率为36.7%，这与Ranogajec等[6](36.2%, 50/138)报道的数据较为一致。本研究还证实，APN在乳腺癌组织上的阳性表达高于癌旁正常乳腺组织。

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其病理分型较多，预后差别大。常用的预测因子，包括淋巴结转移情况、组织学分级、肿瘤大小、绝经状态、ER、PR和Her-2蛋白表达情况等。本研究分析了APN的表达情况与乳腺癌常用预后因子的关系，发现APN多表达于浸润性导管癌，与肿瘤组织类型相关，而与淋巴结转移状态无关。Ranogajec等[6]曾研究表明乳腺癌APN的表达与淋巴结转移状态无相关性，但淋巴结阳性组APN在乳腺癌上的表达更强。有关肺癌的研究发现，鳞癌组织APN的表达与淋巴结转移状态有显著相关性，而腺癌组织APN的表达与淋巴结转移状态无相关性，作者分析其原因，可能由于腺癌组织APN主要表达于肿瘤实质细胞，间质表达缺乏，所以与淋巴结转移状态无相关性，而鳞癌组织APN主要表达于肿瘤间质细胞，累及成纤维细胞和血管内皮细胞，更有利于肿瘤的侵袭、转移，所以与淋巴结转移状态有显著相关性。本研究显示，乳腺癌APN主要表达于肿瘤细胞，间质细胞表达缺乏，可能提示本研究APN表达与淋巴结转移状态无关的机制。有关APN在乳腺癌上表达情况与淋巴结状态及与乳腺癌其它预后因子的关系还需进一步研究。Ranogajec等[6]研究还发现乳腺癌APN的表达与总生存时间呈负相关趋势，类似的结果在其他肿瘤上也有发现，如胃癌、肺癌等[7-8]。提示APN可以作为恶性肿瘤的不良预后因素之一。

在金属蛋白酶家族中，除了APN外，还有一种锌离子依赖性金属蛋白酶—基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases，MMPs)，MMPs与恶性肿瘤的浸润与转移的发生和发展密切相关。MMPs是一大类锌依赖性内肽酶家族，在胚胎发育、血管生成、伤口愈合等生理过程中参与正常组织的重构，在肿瘤的发生发展中也扮演着重要的角色。其中MMP-2和MMP-9，参与肿瘤细胞外基质的降解，在肿瘤侵袭和转移过程中起着关键作用[9]。MMP-2，又称为明胶酶A、IV型胶原酶，主要降解IV型胶原蛋白、层粘连蛋白。MMP-9,又称明胶酶 B，可以降解IV, V, XI, XVI型胶原蛋白、弹力蛋白。多项研究表明，MMP-2、MMP-9在多种恶性肿瘤中过表达，其表达与肿瘤的发生发展呈正相关[10-11]。

Terauchi M等[5]发现APN可以促进卵巢癌细胞株分泌MMP-2。另有实验应用APN抑制剂抑制APN活性后，可以通过抑制或者激活某些因子，影响MMP分子的表达情况，从而抑制MMP对基底膜的降解[12]。多项研究表明，APN与MMPs在促进肿瘤的侵袭机制上有相同之处，即均可通过其蛋白水解酶的作用降解细胞外基质，达到侵袭的目的。因此可以推测APN和MMPs在恶性肿瘤的浸润转移过程中可能起一定的协同作用。因而本研究比较了APN、 MMP-2、MMP-9三者在乳腺癌组织上的表达情况，观察它们在乳腺癌中有无相关性。结果显示，MMP-2、MMP-9在乳腺癌上高表达，然而，未发现APN与MMP-2、MMP-9有明显相关性。分析其原因，(1)可能是由于样本量不足。(2)可能是由于APN与MMP-2、MMP-9在多种不同机制上参与肿瘤的侵袭转移。APN和TAL6(肿瘤相关抗原L6)组成一个复合体调节细胞迁移能力和侵袭力，但这种能力并不依赖于APN的蛋白水解酶活性[1]；多种肿瘤细胞类型中，APN的表达及其蛋白水解酶活性与肿瘤细胞的侵袭力相关，然而，应用不影响酶切活性的抗APN单克隆抗体作用肺癌细胞，引起APN的交联，亦可以显著抑制肿瘤细胞的迁移，即不影响酶切活性的单克隆抗体依然可以阻断其侵袭力。研究表明，抑制APN活性能有效阻止肿瘤细胞的侵袭转移。因此，对APN在肿瘤侵袭转移中相关机制的进一步深入研究也成为了本组以后研究的方向之一。

参考文献:

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[2] Inagaki Y, Tang W, Zhang L, et al. Novel aminopeptidase N(APN/CDl3) inhibitor 24F can suppress invasion of hepatocellular carcinoma cells as well as angiogenesis[J]. Biosci Trends, 2010, 4(2):56-60.

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基金项目:河北省科学技术厅项目(13397701D)

作者简介:冯 丽(1986-)，女，河北易县人，医师。E-mail:fengye-215@163.com 通信作者:张 静，教授。 E-mail：zhangjing166@126.com

doi:论著10.11724/jdmu.2016.03.03

[中图分类号]R737.9

[文献标志码]A

文章编号：1671-7295(2016)03-0219-05

(收稿日期:2016-01-11;修回日期:2016-05-24)

Aminopeptidase N expression and its correlation with MMP-2, MMP-9 in breast cancer

FENG Li, ZHAO Yu-zhe, CAO Wen-qing, ZHANG Jing

(TheFirstDepartmentofGeneralSurgery,HebeiGeneralHospital,Shijiazhuang050051,China)

[Abstract]Objective To investigate the significance of Aminopeptidase N (APN) expression in breast cancer, and to discuss the role of APN in the process of breast carcinoma invasion and metastasis by analyzing the relationships between APN and Matrix metalloproteinase-2 (MMP-2), Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9). Methods Immunohistochemistry (SP method) was performed to detect the expressions of APN, MMP-2 and MMP-9 in 60 cases of breast cancer tissues, as well as APN expression in 20 cases of adjacent normal breast tissues. Results The positive frequency of APN expression in breast cancer tissues (36.7%, 22/60) was significantly higher than that in adjacent normal breast tissues (0%, 0/20) (χ2=10.115, P=0.001). APN expression was associated with tumor pathological types (P=0.035). However, there was no relationship between the APN expression and other clinicopathological features, such as menopausal state, clinical stage, tumor size, histological grade, nodal status, ER, PR, and Her-2 (P>0.05). There was no significant relationship between the APN expression and MMP-2, MMP-9 expression (P>0.05). Conclusion APN expression was higher in breast cancer than that in normal breast tissues, but it needs further study if APN expression could play a role in invasion and metastasis in breast cancer.

[Key words]aminopeptidase N/CD13; immunohistochemistry; breast cancer; matrix metalloproteinase-2; matrix metalloproteinase-9