丹皮酚、三七总皂苷组方对心肌梗死后心室重构大鼠TGF-β/Smads信号通路的影响

聂丹，孙红丹，时召平，周晓慧



丹皮酚、三七总皂苷组方对心肌梗死后心室重构大鼠TGF-β/Smads信号通路的影响

聂丹1，孙红丹1，时召平2，周晓慧1

摘要：目的探讨丹皮酚、三七总皂苷组方对心梗后心室重构大鼠转化生长因子（TGF）-β/Smads信号通路的影响及可能机制。方法通过结扎左冠状动脉前降支制造大鼠急性心肌梗死模型，依干预方式不同分为模型组、丹皮酚（8 mg·kg-1）组、三七总皂苷（40 mg·kg-1）组、组方低剂量组（丹皮酚4 mg·kg-1+三七总皂苷20 mg·kg-1）、组方高剂量组（丹皮酚8 mg·kg-1+三七总皂苷40 mg·kg-1），卡托普利组（10 mg·kg-1）。另设假手术组，只穿线不结扎。连续给药28 d后检测左心室收缩压（LVSP）、左心室舒张压（LVEDP）、左心室内最大上升和下降速率（±dp/dtmax）；HE染色观察各组大鼠心肌病理学变化；Western blot检测TGF-β1、Smad2/3蛋白的表达。结果用药组与模型组比较，组方组与中药单药组比较，组方高剂量组与组方低剂量组比较，各指标变化均较明显，差异均有统计学意义（P＜0.01）。模型组呈病理改变，各用药组均有不同程度的病理结构改善；组方组和卡托普利组改善最明显。与模型组比较，各用药组TGF-β1、Smad2/3蛋白表达较模型组降低，组方组较丹皮酚组和三七总皂苷组降低；组方高剂量组较组方低剂量组降低（均P＜0.01）。结论丹皮酚、三七总皂苷组方可抑制心肌梗死后心室重构大鼠心肌组织TGF-β1、Smad2/3的蛋白表达，有明显协同作用，其机制可能是通过阻断TGF-β/Smads信号通路实现的。

关键词：心肌梗死；疾病模型，动物；心室重构；转化生长因子β；药物疗法，联合；Smad2/3；丹皮酚、三七总皂苷组方

心室重构是心肌梗死后心脏重要的病理改变，会引起心室肥厚、心率失常、心力衰竭及心源性猝死等并发症。参与心室重构的因素多且互相影响，过程和机制复杂。心室重构后，心肌内大量炎性因子生成，并可与转化生长因子（TGF）-β1相互作用［1］。活化的TGF-β1可诱导Smads家族蛋白磷酸化，促进心肌细胞增殖［2-3］。因此，TGF-β/Smads信号转导通路的异常激活在心室重构过程中起着重要的作用。牡丹皮和三七均可抑制血小板聚集，改善血流动力学，抗心肌缺血、心律失常及动脉粥样硬化，其主要有效成分是丹皮酚和三七总皂苷［4］。有研究证实，丹皮酚和三七总皂苷均有调节TGF-β/Smads信号通路［5］，改善心肌梗死大鼠心功能和抑制心室重构的作用［6-7］。但有关丹皮酚和三七总皂苷联合用药对心肌梗死的疗效研究较少见。本研究旨在探讨丹皮酚和三七总皂苷组方用药在改善心功能和抑制心室重构过程中的作用。

1　资料与方法

1.1一般资料健康SPF级雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠70只，质量180～220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。清洁条件下喂食标准饲料，自由饮水。丹皮酚购自宁波天真制药有限公司；血塞通注射液购自昆明制药集团；卡托普利片购自上海全宇生物科技内乡制药有限公司；青霉素钠购自石药集团中诺药业（石家庄）公司；组织裂解液购自上海贝博生物；TGF-β1蛋白抗体、Smad2/3蛋白抗体购自CST公司；β-actin购自Santacruze公司。一抗、二抗均购自北京中杉金桥公司。DW3000-B型小动物人工呼吸机（淮北正华生物科技有限公司）、ECG-6511型心电图机（上海光电医用电子仪器有限公司）、2K15型高速冷冻离心机（美国Sigma公司）、DYY-BC型电泳仪（北京市六一仪器厂）。

1.2方法

1.2.1急性心肌梗死模型制备及分组随机抽取70只中的10只作为假手术组，只穿线不结扎；另60只通过结扎左冠状动脉前降支制造急性心肌梗死模型，心电图机显示ST段抬高1/2以上表示造模成功［5］。假手术组全部存活，心肌梗死造模组死亡5只。术后24 h，将造模成功大鼠随机分成模型组、丹皮酚（8 mg·kg-1）组、三七总皂苷（40 mg·kg-1）组、组方低剂量组（丹皮酚4 mg·kg-1+三七总皂苷20 mg·kg-1）、组方高剂量组（丹皮酚8 mg·kg-1+三七总皂苷40 mg·kg-1），卡托普利组（10 mg·kg-1）。丹皮酚、三七总皂苷注射剂腹腔注射给药，卡托普利组灌胃给药。各种药物均1次/d。模型组和假手术组每天腹腔注射等体积生理盐水。各组均给予相应干预28 d，期间各用药组死亡7只。

1.2.2血流动力学指标检测给药28 d后，4%水合氯醛麻醉大鼠，分离颈总动脉并迅速与BL-420生物机能实验系统连接，注入肝素抗凝，经颈总动脉将压力传感微导管插入至左心室，稳压10 min，测定左心室收缩压（LVSP）、左心室舒张压（LVEDP）、左心室内最大上升和下降速率（±dp/dtmax），稳定后各个指标记录10个测量值，完毕后腹腔注射KCl处死，使心脏停在舒张期。迅速摘取心脏，一部分放入4%多聚甲醛溶液中固定，用于HE染色；一部分冷冻于-80℃，用于Western blot法检测蛋白。

1.2.3HE染色观察各组心肌组织细胞形态参考文献［8］，取结扎线下3～5 mm处心脏组织于4%多聚甲醛中固定24 h，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，制成蜡块，厚度5 μm连续切片。进行常规HE染色，观察心肌组织病理变化，每张切片随机取5个视野拍照（×200）。

1.2.4Western blot法检测TGF-β1和Smad2/3蛋白表达在低温环境中，将提取好的心肌组织剪碎置于EP管中，按照说明书将RIPA和PMSF混合液加入装有心肌组织的EP管，匀浆至均匀且无肉眼可见固体，将组织液转移至另外预冷的EP管中，4℃，18 000 r·min-1离心5 min，吸取上清液置于预冷的EP管中。BCA法测定蛋白含量，按照说明书将工作液和待测蛋白加入96孔板，37℃孵育30 min后，设定波长为562 nm测定光密度（OD），利用标准曲线计算蛋白浓度待用。将蛋白液与5×上样缓冲液按照按照4∶1比例混合，94℃变性6 min。β-actin用12%SDS-PAGE电泳，Smad2/3、TGF-β1用10%SDS-PAGE胶电泳，冰浴转PVDF膜，之后用5%脱脂牛奶封闭过夜，抗体孵育比例：一抗1∶3 000，室温15 min，37℃30 min后，用TBXT洗涤，用辣根过氧化物酶标记的二抗1∶1 000，室温孵育15 min，37℃20 min TBXT洗涤后，ECL显色。对显色结果进行灰度值扫描，用Quantity One软件进行定量分析，以目的条带和β-actin条带的光密度比值为目的蛋白的相对表达水平。重复5次取平均值。

1.3统计学方法采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量数据用±s表示，组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较用LSD-t法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1心梗大鼠心功能检测结果比较除假手术组外，模型组、丹皮酚组、三七总皂苷组、组方低/高剂量组及卡托普利组的LVSP值呈逐渐减少趋势，但均高于假手术组（P＜0.01）；LVEDP、±dp/dtmax依此顺序呈逐渐增加趋势，但均低于假手术组（P＜0.01）；各用药组与模型组比较，组方组与中药单药组（丹皮酚组和三七总皂苷组）比较，组方高剂量组与组方低剂量组比较，各指标变化均较明显，差异均有统计学意义（P＜0.01），见表1。

2.2各组心肌组织细胞形态变化假手术组心肌细胞染色均匀，排列整齐，胞核胞质清晰，整体无明显病理改变。模型组心肌细胞肥大，细胞核固缩，排列紊乱，细胞间隙变窄，细胞间胶原纤维增生明显，细胞胞质缺失，胞核碎裂。各用药组均有不同程度的病理结构改善。其中组方组和卡托普利组改善最明显，均显示细胞排列整齐，细胞形态趋向正常，染色均匀，细胞间无纤维增生，见图1。

2.3各组心肌TGF-β1和Smad2/3蛋白的表达水平比较与假手术组相比，模型组TGF-β1和Smad2/3蛋白的表达增强；与模型组相比，各用药组蛋白的表达降低；组方组较丹皮酚组和三七总皂苷组降低；组方高剂量组较组方低剂量组降低（均P＜0.01），见图2、表2。

Tab.1　Comparison of LVSP，LVEDP and±dp/dtmaxbetween seven groups表1　各组大鼠LVSP、LVEDP、±dp/dtmax检测结果比较　（±s）

Tab.1　Comparison of LVSP，LVEDP and±dp/dtmaxbetween seven groups表1　各组大鼠LVSP、LVEDP、±dp/dtmax检测结果比较　（±s）

＊＊P＜0.01；a～f分别为与（1）～（6）组比较，P＜0.01；1 mmHg=0.133 kPa；表2同

组别假手术组（1）模型组（2）丹皮酚组（3）三七总皂苷组（4）组方低剂量组（5）组方高剂量组（6）卡托普利组（7）F n 10 8 8 7 8 9 8 LVSP（mmHg）4.56±0.35 13.41±0.64a11.19±0.50ab10.28±0.62abc7.57±0.50abcd6.10±0.33abcde5.80±0.15abcdef234.035＊＊LVEDP（mmHg）151.45±4.67 102.68±3.65a112.56±3.30ab126.93±2.98abc135.64±3.27abcd140.30±3.95abcde146.34±1.05abcdef137.654＊＊+dp/dtmax（mmHg·s-1）3 639.29±247.17 1 282.79±78.68a1 481.97±79.89ab1 668.84±91.74abc2 129.62±123.30abcd2 867.98±99.33abcde3 052.39±75.52abcdef247.847＊＊-dp/dtmax（mmHg·s-1）3 126.52±147.14 975.76±44.77a1 189.16±45.29ab1 382.18±87.98abc1 899.70±98.93abcd2 465.75±85.24abcde2 719.87±113.81abcdef376.369＊＊

Fig.2　TGF-β1 and Smad2/3 protein expressions in myocardial tissues of seven groups图2　TGF-β1和Smad2/3蛋白在各组大鼠心肌组织中的表达

Tab.2　TGF-β1 and Smad2/3 protein expressions in myocardial tissues of seven groups表2　TGF-β1和Smad2/3蛋白在各组大鼠心肌组织中的表达　（±s）

Tab.2　TGF-β1 and Smad2/3 protein expressions in myocardial tissues of seven groups表2　TGF-β1和Smad2/3蛋白在各组大鼠心肌组织中的表达　（±s）

组别假手术组（1）模型组（2）丹皮酚组（3）三七总皂苷组（4）组方低剂量组（5）组方高剂量组（6）卡托普利组（7）F n 10 8 8 7 8 9 8 TGF-β1/β-actin 0.07±0.01 0.40±0.02a0.32±0.02ab0.26±0.03abc0.16±0.02abcd0.11±0.01abcde0.08±0.01abcdef229.573＊＊（Smad2/3）/β-actin 0.08±0.02 0.44±0.04a0.38±0.03ab0.34±0.03abc0.26±0.02abcd0.21±0.05abcde0.13±0.01abcdef84.768＊＊

3　讨论

心室重构是心肌梗死的重要病理改变，并且贯穿病程始终，是心肌梗死后导致心力衰竭的主要病理基础，也是影响心肌梗死预后的主要原因［9］。心室重构的主要病理学改变为心脏梗死区心室变薄、非梗死区代偿性肥厚、心腔扩大、心脏收缩舒张功能受损，引起血流动力学改变；肾素-血管紧张素-醛固酮系统变化，神经激素细胞因子等表达变化，引起心肌细胞坏死，坏死部位瘢痕化并产生代偿性纤维增殖，心肌间质纤维化，细胞外基质沉淀等，最终造成心力衰竭［10-11］。TGF-β/Smads信号转导通路在高血压、冠心病、心肌梗死、动脉粥样硬化等心血管疾病的发病中发挥重要的作用［12］。

TGF-β是细胞分泌的生长因子。Yuan等［13］研究表明，心室重构后心肌组织中TGF-β1的含量显著增多，并且被快速激活，通过细胞内信号转导发挥重要作用。Smads家族蛋白是TGF-β/Smads信号转导通路中重要的底物。TGF-β1与TGF-β1受体Ⅱ结合，促进TGF-β1受体Ⅰ磷酸化并形成TGF-β受体Ⅰ、Ⅱ型受体复合物，催化Smad2/3表达增强且磷酸化，与Smad4形成复合体，激活核因子（NF）-κB，使其进入细胞核，最终实现调控基因转录作用，使细胞增殖、胶原增多、间质纤维化，从而导致心室重构［1］。张秀静等［5，7］研究已证实，丹皮酚和三七总皂苷均可改善心肌梗死大鼠心功能，对TGF-β/Smads信号通路具有转导作用。血流动力学方面，+dp/dtmax反映心脏左室收缩功能，LVEDP和-dp/dtmax反映心脏左室舒张功能，一般情况下，心梗后±dp/dtmax降低，LVEDP升高。本研究结果显示，各用药组较模型均能明显升高±dp/dtmax、LVEDP，降低LVSP，提示各组药物对心梗后大鼠均有一定的改善作用；各用药组与模型组比较，组方组与中药单药组比较，组方高剂量组与组方低剂量组比较，各指标变化均较明显，表明与中药单药组相比，配伍用药改善心功能的作用更强，并且随着配伍剂量增加效果更佳，提示对于提高心肌梗死大鼠心功能，二者配伍可能具有协同作用。本研究形态学结果显示，假手术组无明显病理改变，心肌细胞轮廓清晰，排列整齐，胞核胞质清晰分明，细胞间胶原无增生；模型组心肌细胞肥大，核固缩，排列紊乱，细胞间间隙变窄，间质增生明显，各用药组病理改变均有不同程度改善，其中组方用药组比中药单药组效果好，并且随组方剂量加大，病理改变越不明显，证实了丹皮酚、三七总皂苷配伍可能具有协同作用。

另外，与模型组比较，各用药组TGF-β1和Smad2/3蛋白均有一定程度减少，提示丹皮酚、三七总皂苷在改善心肌梗死大鼠心功能和心室重构的分子机制可能与减少TGF-β1和Smad2/3有关，即与阻断TGF-β/Smads信号转导通路有关；组方组与中药单药组相比，TGF-β1和Smad2/3表达减少显著，提示两药配伍使用可能具有协同作用；并且，配伍使用时，组方高剂量组比低剂量组效果更好，提示配伍使用时可能具有一定的协同作用。

（图1见插页）

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（2015-09-08收稿2015-10-31修回）

（本文编辑陆荣展）

The effects of combination of paeonol and PNS on TGF-β/Smad pathway in ventricular remodeling after myocardial infarction in rats

NIE Dan1，SUN Hongdan1，SHI Zhaoping2，ZHOU Xiaohui1
1 Key Laboratory of Study and Exploiture for New Drugs of Traditional Chinese Medicine（TCM），Institute of TCM Medical of Chengde Medical College，Chengde 067000，China；2 Chengde Traditional Chinese Medicine Hospital Corresponding AuthorE-mail：zxh5055@sina.com

Abstract：ObjectiveTo study the effect of paeonol（PAE）and PNS on the expression of transforming growth factor （TGF）-beta 1/Smad2/3 pathway in rats with acute myocardial infarction（AMI），and the possible molecular mechanism thereof.MethodsModel of AMI was made using left anterior descending coronary branch ligation.According to the intervention methods rats were divided into model group，PAE group（8 mg·kg-1），PNS group（40 mg·kg-1），PAE（4 mg·kg-1）+ PNS（20 mg·kg-1）low dose group，PAE（8 mg·kg-1）+PNS（40 mg·kg-1）high dose group and captopril positive control group （10 mg·kg-1）.Rats without ligation were used as Sham operation group.Left ventricular systolic blood pressure（LVSP），left ventricular diastolic pressure（LVEDP）and the maximum rise and fall rate（/dtmax DP）were detected after 28-day treatment.HE staining was used to observe changes of myocardial tissue.The protein expression levels of TGF-β1 and Smad2/3 were detected by Western blot assay.ResultsThere were significant differences in parameters used for detecting treatment group and model group，formula group and single drug group，formula high dose group and formula low dose group（P＜0.01）.The model group showed pathological changes.All treatment groups showed different degrees of pathological improvement.There was the most significant improvement in formulae group and captopril group.Compared with the model group，TGF-β1 and Smad2/3 protein expressions were decreased in treatment group.The expression levels of TGF-β1 and Smad2/3 were significantly decreased in formula group than those of PAE group and PNS group，and lower levels in formula high dose group than those of formula low dose group（P＜0.05）.ConclusionPaeonol and PNS can inhibit the expressions of TGF-β/ Smad 2/3 protein in rats with AMI，by blockingTGF-β/Smad pathway.

Key words：myocardial infarction；disease models，animal；ventricular remodeling；transforming growth factor beta；drugtherapy，combination；Smad2/3；compound of Paeonol and PNS

中图分类号：R542.22，R969.3

文献标志码：A

DOI：10.11958/20150146

基金项目：河北省自然科学基金项目（C2011406009）；河北省教育厅重点项目（Z20131068）

作者单位：1承德医学院中药研究所，河北省中药研究与开发重点实验室（邮编067000）；2承德市中医院药剂科

作者简介：聂丹（1991），女，硕士在读，主要从事心血管药理学研究

通讯作者E-mail：zxh5055@sina.com