人鼻咽癌耐药裸鼠移植瘤模型的建立及耐药性检测

褚德雅　刘森　朱名毅　彭丽雲　刘津　高洁　卢露碧



·论著·

人鼻咽癌耐药裸鼠移植瘤模型的建立及耐药性检测

褚德雅刘森朱名毅彭丽雲刘津高洁卢露碧

533000广西壮族自治区百色市，右江民族医学院附属临床学院(褚德雅、刘森、彭丽雲、刘津)；右江民族医学院基础医学院(朱名毅、高洁、卢露碧)

【摘要】目的优化建立人鼻咽癌CNE-1/顺铂耐药裸鼠移植瘤模型的方法，并检测其药耐药性，为后续鼻咽癌的耐药机制研究奠定基础。方法采用顺铂诱导鼻咽癌CNE-1细胞，建立其多药耐药细胞株CNE-1/顺铂细胞；将3个不同浓度的耐药细胞分别接种于裸鼠皮下，观察其成瘤性及转移情况；蛋白印迹法检测LRP、VEGF、Bcl-2在CNE-1细胞、CNE-1/顺铂耐药细胞和移植瘤的表达情况。结果经顺铂诱导建立了鼻咽癌CNE-1/顺铂耐药细胞株；其对顺铂、长春新碱和紫杉醇的耐药性分别增加35.83、23.74和10.54倍。5×106/ml的耐药细胞成瘤率为83.33%，其他2个浓度耐药细胞未见成瘤，所有裸鼠均未见肝、肺等器官出现转移瘤。LRP、VEGF和Bcl-2蛋白在耐药细胞和移植瘤中的表达均高于CNE-1细胞(P<0.05)。结论CNE-1/顺铂耐药细胞的成瘤性与细胞浓度有关，CNE-1耐药细胞移植瘤依然保持很好的耐药性，可为鼻咽癌耐药逆转剂的研究提供较理想的动物模型。

【关键词】鼻咽肿瘤；耐药性；移植瘤

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)为华南各省最常见的恶性肿瘤之一，以早期淋巴道转移为特征，鼻咽癌耐药的出现，极大降低了临床治疗效果[1]。为了深入研究鼻咽癌耐药的生物学行为特征，需要建立鼻咽癌耐药动物模型。目前，在裸鼠中建立肿瘤模型是研究肿瘤生物学特性的基本手段[2]，但在BALB/c裸鼠上建立鼻咽癌耐药移植瘤并对移植方法及移植瘤的生长特性进行观察和研究，目前笔者尚未见相关报道。因此，我们拟利用鼻咽癌CNE-1/顺铂耐药细胞株建立鼻咽癌耐药移植瘤模型，初步观察移植瘤的耐药特征。

1材料与方法

1.1材料人鼻癌细胞株CNE-1购自中国科学院上海细胞生物研究所，由右江民族医学院科学实验中心保存。BALB/c裸鼠18只，8周龄，雄性18～22 g，购自广西医科大学实验动物中心，在右江民族医学院SPF级动物房饲养。PRMI-1640培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、顺铂和四甲基偶氮唑盐购自美国Sigma公司，MRP、VEGF和Bcl-2抗体及相关蛋白印迹试剂购自美国Santa Cruz公司。

1.2方法

1.2.1人鼻咽癌CNE-1/顺铂耐药细胞株的建立：参照文献[3]采用逐步增加顺铂浓度的方法建立人鼻咽癌CNE-1/顺铂耐药细胞株，选择对数生长期的CNE-1细胞，用含有顺铂的培养基进行传代培养，顺铂初始浓度为0.05 μg/ml，按0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0、8.0 μg/ml逐步将浓度增加，直至细胞不能耐受为止，细胞要在每个浓度中稳定生长并传代3次。 经过2个月观察和实验，确定1.0 μg/ml为CNE-1细胞的极限耐受浓度，细胞生长稳定，经1.0 μg/ml筛选传代5次后，诱导出鼻咽癌CNE-1/顺铂耐药细胞株，用于后续实验。

1.2.2MTT法检测耐药性：MTT法检测CNE-1和CNE-1/顺铂耐药细胞对顺铂、长春新碱、紫杉醇的耐药性，具体实验步骤按照说明书操作。1×104个/ml 细胞接种于96孔板，24 h后更换含有序列稀释化疗药(顺铂、长春新碱或紫杉醇)的培养基，继续培养68 h，每孔加入10 mg/ml的MTT溶液 20 μl，再继续培养4 h，吸除旧培养液，每孔再加入DMSO 200 μl，轻微振荡5 min使溶解结晶。检测波长为570 nm，用酶标仪进行OD值检测，根据Bliss法计算IC50值。耐药指数(RI)=(CNE-1细胞IC50)/(CNE-1/顺铂耐药细胞IC50)。

1.2.3裸鼠人鼻咽癌CNE-1/顺铂移植瘤模型的建立及观察转移情况：取裸鼠18只，随机分为3组，低浓度组(5×104个/ml)、中浓度组(5×105个/ml)和高浓度组(5×106个/ml)。取对数生长期的耐药细胞，按分组要求分别接种0.2 ml细胞于BALB/c裸鼠右侧腋窝皮下。每日观察肿瘤生长情况及裸鼠生活习性，连续观察8周。8周后颈椎脱臼处死裸鼠，解剖取肿瘤，用精密游尺测量肿瘤体积，肿瘤体积计算公式：V=ab2/2，V为体积，a为长径，b为横径。1/2肿瘤组织甲醛固定，石蜡包埋，做病理切片及HE染色，另1/2组织-80℃冻存用于后续的蛋白印迹实验。解剖胸腔和腹腔观察肝、肺等脏器的肿瘤转移情况。同时取部分肺和肝脏组织进行病理切片及HE染色。

1.2.4蛋白印迹法检测LRP、VEGF和Bcl-2的表达情况：CNE-1细胞株、CNE-1/顺铂耐药细胞株和肿瘤组织按照试剂说明书的具体步骤进行蛋白提取，分光光度计测总蛋白浓度，上样缓冲液调整蛋白浓度。15%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，再电转移到PVDF膜，37℃下用10%脱脂奶粉封闭1 h，分别加入相应一抗，4℃冰箱孵育过夜，洗膜后加入二抗，室温孵育2 h，洗膜后加入ECL曝光、显影，以β-actin为内参。将胶片扫描后，用Image Pro Plus7.0软件测量目的蛋白及其内参β-actin的吸光度值，目的蛋白的相对表达量为目的蛋白吸光度值/内参β-actin蛋白吸光度值。

2结果

2.1CNE-1细胞和CNE-1/顺铂细胞的耐药性检测与CNE-1细胞相比，CNE-1/顺铂耐药细胞的IC50值均有显著增加(P<0.05)，即CNE-1/顺铂细胞对顺铂、长春新碱、紫杉醇的耐药分别是CNE-1细胞的35.83、23.74和10.54倍。见表1。

表1不同药物在CNE和CNE/DDP中的IC50值及耐药指数

化疗药物IC50(μg/ml)CNE-1CNE-1/顺铂耐药指数(RI)顺铂0.982±0.08135.186±1.403*35.83长春新碱0.062±0.0081.472±0.146*23.74紫杉醇0.098±0.0121.033±0.119*10.54

注：与CNE-1比较，*P<0.05

2.2CNE-1/顺铂耐药细胞的成瘤性及转移情况3组裸鼠接种耐药细胞后，其中5×106/ml组有5只裸鼠成瘤，成瘤率为83.33%，其他组裸鼠则未见成瘤，所有裸鼠荷瘤期间生活习性和饮食无明显变化。取材时，肿瘤重量为(1.02±0.23)g，大小为(0.416±0.125)cm3，肿瘤均未发生破溃坏死。移植瘤组织HE染色见：肿瘤细胞分化差，以大圆细胞为主，形成癌巢，细胞质较丰富、淡染，核仁大小不一，组织间可见少量新生血管。肝脏和肺组织的病理切片未见肿瘤转移灶。见图1。

2.3蛋白印迹检测LRP、VEGF和Bcl-2蛋白的表达情况Western blot实验结果显示：LRP、VEGF和Bcl-2蛋白在CNE-1/DDP细胞和移植瘤中的表达均明显高于CNE-1细胞，差异有统计学意义(P<0.05)；LRP、VEGF和Bcl-2在CNE-1/顺铂细胞株和移植瘤比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2，图2。

裸鼠移植瘤组织(HE×200)裸鼠肝脏组织(HE×100)裸鼠肺组织(HE×100)

图1裸鼠移植瘤、肝和肺的病理切片

表2LRP、VEGF和Bcl-2蛋白在CNE-1细胞、CNE-1/顺铂细胞和移植瘤中的表达

类别LRPVEGFBcl-2CNE-1细胞0.14±0.030.30±0.050.17±0.05CNE-1/顺铂细胞0.47±0.07*1.08±0.12*0.59±0.08*移植瘤0.48±0.09*#1.06±0.15*0.62±0.10*

注：与CNE-1细胞比较，*P<0.05

图2LRP、VEGF和Bcl-2蛋白在CNE-1细胞、CNE-1/顺铂细胞和移植瘤中的表达

3讨论

低分化鳞癌是我国鼻咽癌最常见的病理类型，其对化疗比较敏感，但是对于中晚期鼻咽癌则需要化疗结合放疗[4]。鼻咽癌化疗的药物主要有铂类、植物生物碱类、烷化剂类和抗代谢类等。目前治疗鼻咽癌最常用的药物是顺铂，其作用机制是能与DNA链产生交叉联结，从而抑制DNA的正常功能，而且，其还具有增加放疗的作用[5]。但是近几年，临床医生发现患者使用顺铂化疗药物一段时间后，会出现耐药而影响化疗效果[6]。因此目前鼻咽癌研究的重点之一是如何降低鼻咽癌细胞对各种化疗药物的耐药性，增强其对化疗药物的敏感性。

肿瘤体内研究中不可缺少的手段是在动物身上复制人类肿瘤，建立人类鼻咽癌鼠移植瘤模型是目前研究鼻咽癌的病因学、发病学及治疗的理想实验模型。在早期的实验中，我们建立了人鼻咽癌铂耐药细胞株(Tw03/DDP)，并对其耐药机制进行了体外的细胞学研究，发现鼻咽癌对顺铂获得性耐药具有多药耐药性的特点，可以显著增加紫杉醇、5-氟尿嘧啶、阿霉素和长春新碱的耐药指数，其耐药性的产生可能与肺耐药蛋白(lung resistance protein，LRP)的高表达有关[3]。我们在CNE-1/顺铂耐药细胞株也发现其有同样的多药耐药特性，CNE-1/顺铂耐药细胞对顺铂、长春新碱和紫杉醇的耐药分别增加了35.83、23.74和10.54倍，同样LRP蛋白的表达也增加了2.98倍。这些实验结果说明，耐药细胞的产生会明显降低化疗药物的临床治疗效果，其具体机制可能与耐药蛋白的形成有关。LRP是常见的耐药蛋白之一，其主要通过胞吐或囊泡转运机制将细胞内的化疗药物排到细胞外，从而降低细胞内的药物浓度，导致化疗作用降低[7]。有学者发现多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein，MRP)、LRP在大肠癌中均有不同程度的高表达，而且MRP与LRP的表达呈正相关[8]。

虽然，在裸鼠中建立肿瘤模型的文献很多，但鲜有文献报道肿瘤细胞浓度与移植瘤生长特性的研究和观察。我们将3种不同浓度的耐药细胞注射到裸鼠腋窝，结果发现成瘤的难易与肿瘤细胞浓度成正相关，只有浓度为5×106/ml组中有5只裸鼠成瘤。究其原因，BALB/c裸鼠虽T细胞免疫缺陷，但有B淋巴细胞介导的体液免疫，皮下接种的耐药细胞过少，易被裸鼠的体液免疫清除[9]。因此，我们认为5×106个/ml的肿瘤细胞皮下接种是较为理想的，此浓度肿瘤细胞致瘤成功率高，且潜伏时间较短。

肿瘤细胞的凋亡决定着肿瘤的发生和发展，而新生的血管为肿瘤生长提供了营养[10，11]。Bcl-2基因是原癌基因之一，它能够抑制肿瘤细胞的凋亡，Bcl-2表达上调与肿瘤细胞的耐药有密切关系[12，13]。在人脑胶质瘤细胞AM38中抑制miR-16后，可以上调Bcl-2蛋白的表达，进而增加胶质瘤细胞AM38对化疗药替莫唑胺的敏感性[14]。VEGF是血管形成调控分子，具有促进血管形成的作用，不少文献报道肿瘤细胞耐药的新机制与VEGF表达增加有关[15]。在我们的实验中发现，LRP、VEGF和Bcl-2蛋白在CNE-1/顺铂耐药细胞和移植瘤中的表达均高于CNE-1细胞，差异有统计学意义(P<0.05)。这些结果说明，肿瘤细胞的耐药性在移植瘤中得到继续保留，所以用耐药细胞来建立耐药移植瘤是可行的，为进一步体内研究耐药性提供很好的实验动物载体。肿瘤细胞形成耐药性后，Bcl-2蛋白表达增加，从而导致肿瘤细胞的凋亡数量减少，使得肿瘤不断增长。有研究发现，通过调控作用抑制Bcl-2蛋白的表达，可增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[16]。同样，我们还发现肿瘤细胞耐药性形成的同时，会增加其VEGF蛋白的表达，但具体机制不详。有学者认为在耐药过程中高表达的LRP、VEGF和Bcl-2也能促进肿瘤细胞的耐药性，也就说它们是相互促进，恶性循环的[17]。目前研究发现LRP高表达可能与肿瘤中VEGF基因表达上调及VEGF促进肿瘤血管生成增加有关，而抑制肿瘤新生血管的生成可以降低肿瘤细胞对化疗的耐药性[18]。

综上所述，本研究通过建立裸鼠耐药移植瘤的实验，发现一定浓度的耐药细胞才能在裸鼠皮下生成移植瘤。CNE-1/顺铂耐药细胞及其移植瘤中LRP、VEGF和Bcl-2蛋白的表达显著高于CNE-1细胞，耐药细胞形成的移植瘤依然保留其耐药特性。这些研究结果为深入阐明鼻咽癌细胞的耐药机制，发现耐药逆转分子及其作用机制，进一步指导鼻咽癌的综合治疗提供了实验依据。

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Establishment of drug resistance transplanted tumor models in nude mice with human nasopharyngeal carcinoma CNE-1/DDP and drug resistance detection

CHUDeya*,LIUSen*,ZHUMingyi,etal.

*AffiliatedHospitalofYoujiangNationalityMedicalUniversity,Guangxi,Baise533000,China

【Abstract】ObjectiveTo look for optimized methods to establish drug resistance transplanted tumor models in nude mice with human nasopharyngeal carcinoma CNE-1/DDP (cisplatin), and to detect its drug resistance in order to set up the foundation for the follow-up researches about the mechanism of drug resistance of nasopharyngeal carcinoma (NPC).MethodsThe multidrug resistant cell line CNE-1/DDP cells were established by cisplatin induction,then the three different concentrations of drug-resistant cells were inoculated subcutaneously into nude mice, respectively, and to observe the tumorigenicity and metastasis,The expression levels of LRP,VEGF and Bcl-2 in CNE-1 cells, CNE-1/DDP resistant cells and transplanted tumor were detected by Western Blotting.ResultsThe nasopharyngeal carcinoma CNE-1/DDP resistant cell lines were successfully established by cisplatin induction,and its drug tolerance to DDP, vincristine and paclitaxel increased 35.83,23.74 and 10.54 times,respectively, as compared with that in CNE-1 cells,The successful rate of transplantation tumor was 83.33% by means of CNE-1/DDP resistant cells at 5×106/ml, however, transplantation tumor was not induced by the other two concentrations of drug-resistant cells,moreover, the tumor metastases in liver, lungs and other organs were not observed in all the nude mice.The expression levels of LRP, VEGF and Bcl-2 in resistant cells and transplanted tumor were significantly higher than those in CNE-1 cells (P<0.05).ConclusionThe tumorigenicity of CNE-1/cisplatin resistant cells is related with cells concentration,the transplantation tumor of CNE-1 resistant cells keeps still drug tolerance,which can provide ideal animal models for the researches about reversal agent of drug resistance of nasopharyngeal carcinoma.

【Key words】nasopharyngeal carcinoma；drug tolerance；transplantation tumor

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.13.001

通讯作者：朱名毅，533000广西壮族自治区百色市，右江民族医学院基础医学院；

【中图分类号】R 739.6

【文献标识码】A

【文章编号】1002-7386(2016)13-1925-04

(收稿日期：2016-01-11)

项目来源：广西自然科学基金项目(编号：2013GXNSFBA019193)；右江民族医学院大学生创新训练计划立项项目(编号：XJCXA201409)

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