槲皮素作为荧光探针对氟离子的识别作用

杨世龙，姜维娜，印 彬，徐 莉2, , 4*，赵俸艺，

高步红4，孙海军4，杜丽婷4，唐 颖4, 5，曹福亮2, 5

1. 南京林业大学化学工程学院，江苏 南京 210037 2. 南京林业大学南方现代林业协同创新中心, 江苏 南京 210037 3. 南京林业大学理学院，江苏 南京 210037 4. 南京林业大学现代分析测试中心，江苏 南京 210037 5. 南京林业大学林学院，江苏 南京 210037

槲皮素作为荧光探针对氟离子的识别作用

杨世龙1, 2，姜维娜1, 2，印 彬3，徐 莉2, 3, 4*，赵俸艺2, 5，

高步红4，孙海军4，杜丽婷4，唐 颖4, 5，曹福亮2, 5

1. 南京林业大学化学工程学院，江苏 南京 210037 2. 南京林业大学南方现代林业协同创新中心, 江苏 南京 210037 3. 南京林业大学理学院，江苏 南京 210037 4. 南京林业大学现代分析测试中心，江苏 南京 210037 5. 南京林业大学林学院，江苏 南京 210037

槲皮素；荧光探针；氟离子；阴离子；天然产物

引 言

氟是人体中不可缺少的元素，主要存在于骨骼和牙齿中，具有增强骨骼和牙齿强度等作用，但是体内氟元素过高，会引起氟中毒，例如厌食、恶心、腹痛、胃溃疡、内脏器官损伤甚至死亡；氟元素过少则会出现软骨病、龋齿等疾病[1-2]。随着工业化的发展，氟元素广泛应用到化工、日化产品中，也造成了一定的环境污染，对人体健康的威胁不容忽视，因此，监测体内和环境中的氟含量是一项具有重大意义的工作。目前，检测氟离子的方法有很多种，例如： 离子色谱法、氟离子选择电极、光散射等[3-5]，这些方法都要用到许多精密仪器，保养维护工作较多，且对样品前处理要求严格，操作程序较多，因此检测成本高、效率较低。荧光光谱分析法具有检测下限低，灵敏度较高，检测速度快等优点，已广泛应于检测阳离子、阴离子和药物等。目前，用于识别氟离子的荧光探针[6-7]多为合成得到，而采用天然产物作为探针直接检测氟离子还未见报道。本实验采用广泛存在于植物体内的槲皮素(Quercetin, Q)作为荧光探针来检测氟离子。槲皮素是黄酮类化合物中最常见的一种，广泛存在于植物的花、叶和果实中，例如银杏叶、槐花米等。由于槲皮素具有抗氧化、扩张血管、改善认知能力等多种生物活性[8]，越来越受到人们的重视，目前有关槲皮素的研究主要集中于其生物活性，有关槲皮素的荧光性能研究较少。有文献报道[9]核苷酸可以增强槲皮素的荧光强度，由此根据槲皮素的荧光强度变化来测量核苷酸的含量，但未见槲皮素作为荧光探针检测阴离子含量的报道。由于槲皮素含有多个酚羟基，易于形成氢键，而氢键的改变会影响槲皮素的共轭体系，对其荧光光谱产生影响，因此可以利用荧光光谱的变化来检测阴离子。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Lambda 950紫外光谱仪(美国珀金埃尔默公司)；LS55荧光分光光度计(激发波长390 nm, 美国珀金埃尔默公司)；AVANCE Ⅲ600核磁共振仪(600M, BrukerBiospin)；电子天平(瑞士 METTLER TOLEDO公司)；WRR熔点仪(上海仪电物理光学仪器有限公司)。

四丁基氟化铵，四丁基磷酸二氢铵，过氯酸四丁基铵(阿拉丁试剂有限公司)；四丁基碘化铵，四丁基氯化铵(国药集团化学试剂有限公司)；四丁基溴化铵(上海凌峰化学试剂有限公司)；二甲基亚砜(DMSO，南京化学试剂有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 槲皮素的提取与纯化

槲皮素按文献方法从银杏叶或槐花米中提取[10]。mp.>300 ℃；ESI-MSm/z301[M-H]-；1H NMR (DMSO-d6600 MHz): 12.50 (s, 1H, 5-OH), 10.78 (s, 1H, 7-OH), 9.59 (s, 1H, 3-OH), 9.37 (s, 1H, 4’-OH), 9.31 (s, 1H, 3’-OH), 7.68 (d,J=1.8 Hz, 1H, 2’-H), 7.54 (d×d,J1=10.8 Hz,J2=1.8 Hz, 1H, 6’-H), 6.89 (d,J=8.4 Hz, 1H, 5’-H), 6.41 (d,J=2.4 Hz, 1H, 8-H), 6.19 (d,J=1.8 Hz, 1H, 6-H)。

1.2.2 槲皮素对阴离子的选择性

为研究其他阴离子对槲皮素检测氟离子的干扰，向槲皮素-氟离子体系中分别加入不同的阴离子，并检测加入其他阴离子前后荧光发射强度的变化。根据荧光发射强度变化来判断其他阴离子对氟离子检测的干扰程度，溶液中槲皮素与阴离子的浓度均为1×10-5mol·L-1。

1.2.3 槲皮素与氟离子的荧光滴定光谱

分别配制浓度为1×10-5mol·L-1的槲皮素DMSO溶液和浓度为4×10-4mol·L-1的四丁基氟化铵DMSO溶液。取2 mL槲皮素溶液，向其中连续加入5 μL 四丁基氟化铵溶液，充分混匀后测定荧光强度的连续变化，直至光谱不再有变化。

1.2.4 槲皮素与氟离子作用机理

为研究槲皮素与氟离子的作用机理，将槲皮素-氟离子体系溶于含有不同比例水的DMSO溶液中，考查荧光强度与含水比例的关系。

将等量槲皮素与四丁基氟化铵溶于DMSO-d6中，进行核磁共振谱测试，根据核磁共振数据推测槲皮素与氟离子的作用机理。

1.2.5 氟离子的测定

为考查工作曲线的准确性，配制浓度为1×10-5mol·L-1的槲皮素DMSO溶液，并分别配制浓度为1.0×10-3，2.2×10-3和 3.0×10-3mol·L-1的四丁基氟化铵DMSO溶液。取2 mL槲皮素溶液，向其中加入5μL 四丁基氟化铵溶液，使最终溶液中氟离子浓度分别为2.5×10-6，5.5×10-6和7.5×10-6mol·L-1，充分混匀后分别测定荧光强度，根据工作曲线计算测量值和回收率。

2 结果与讨论

2.1 紫外-可见光谱分析

图1 不同阴离子对槲皮素的紫外-可见吸收光谱的影响(槲皮素与阴离子浓度均为1×10-5mol·L-1)

Fig.1 The influence of different anions on UV-Vis absorption ofQin DMSO([Q]=[anions]=1×10-5mol·L-1)

图示1 槲皮素的化学结构

图2 加入不同阴离子后槲皮素溶液颜色的变化

2.2 槲皮素对不同阴离子的选择性

图3 不同阴离子对槲皮素荧光强度的影响(a)和影响程度(b)(槲皮素与阴离子的浓度均为1×10-5mol·L-1)

Fig.3 Fluorescence intensity ofQresponse to different anions (a) and the degree of response to different anions (b) ([Q]=[anions]=1×10-5mol·L-1)

图4 其他阴离子对槲皮素-氟离子体系荧光强度的影响(λex=390 nm，槲皮素浓度为1×10-5mol·L-1，氟离子浓度为4×10-6mol·L-1，其他阴离子浓度为1×10-5mol·L-1)

Fig.4The influence of other anions on fluorescent intensity of Q-F-system(λex=390 nm, [Q]=1×10-5mol·L-1, [F-]=4 ×10-6mol·L-1, the concentration of other anions was 1× 10-5mol·L-1)

图5 槲皮素对氟离子的荧光滴定光谱和滴定曲线[槲皮素浓度为1×10-5mol·L-1，a～l氟离子浓度依次为： (0, 1.0, 2.0, 4.0, 5.0, 6.0, 8.0, 10.0, 12.0)×10-6mol·L-1]

Fig.5 Fluorescence titration of Q and standard curve of fluorescence titration spectra with varying concentrations of F-in DMSO([Q]=1×10-5mol·L-1, from a to l, [F-]=(0, 1.0, 2.0, 4.0, 5.0, 6.0, 8.0, 10.0, 12.0 )×10-6mol·L-1)

2.3 槲皮素检测氟离子的灵敏性

图5为槲皮素与氟离子的荧光滴定光谱及其滴定曲线，随着氟离子浓度的增大，槲皮素荧光强度逐渐降低，当氟离子浓度为9.0×10-6mol·L-1时，荧光滴定光谱基本无变化，达到饱和。以荧光强度为纵坐标，氟离子的浓度为横坐标，得到滴定曲线(见图5插图)：y=-13.36x+173.4(R2=0.991)，线性范围为1.0×10-6～8.0×10-6mol·L-1，最低检测限为1.0×10-7mol·L-1，可以完成对氟离子的微量检测。

2.4 槲皮素对氟离子的识别机理

受体与阴离子间的识别主要通过疏水作用、氢键作用、偶极作用及配位作用等[12]，可以通过实验来确定槲皮素与氟离子的识别机理。以 DMSO为溶剂分别配制1×10-4mol·L-1的槲皮素和氟离子溶液，分别量取100 μL于4个10 mL的容量瓶中，再分别用DMSO，80%，50%，20%的DMSO水溶液定容，充分摇匀后测定荧光光谱。由图6可以看出，随着溶液中水的比例增加荧光强度降低，这是由于质子性溶剂水与槲皮素的DMSO溶液体系形成新的氢键，破坏了原有体系中氢键，致使荧光强度降低[13]；说明槲皮素荧光强度的降低与整个体系的氢键作用有关。同理，氟离子的加入使荧光强度降低，也与引起原有体系氢键的变化有关。

图6 极性溶剂-水对槲皮素-氟离子体系荧光强度的影响(a～d依次是DMSO, 80%, 50%, 20%的DMSO溶液)

Fig.6 Fluorescence intensity of Q-F-in protic solvent-H2O(from a to d, the solvents are DMSO, 80%, 50%, 20% DMSO aqueous solution, respectively)

为了进一步确定槲皮素与氟离子的作用方式，对槲皮素-氟离子体系进行了核磁共振谱测试。将等量槲皮素与四丁基氟化铵溶于DMSO-d6中测氢谱。图7和表1为槲皮素与槲皮素-氟离子体系的核磁谱图及相关数据，未加氟离子时，由于分子间、分子内的氢键作用，槲皮素分子中的羟基氢被固定住，槲皮素分子刚性较强，分子中的氢原子核磁信号较强，峰形尖锐；加入氟离子后，槲皮素-氟离子体系的1H NMR图中10.78 ppm(7—OH)处的峰消失，说明7—OH处的氢键完全被破坏。同时9.31，9.37和9.59 ppm处的峰变为9.68 ppm处的一宽峰，说明3—OH，3′—OH，4′—OH处的氢键作用也变弱。由此说明槲皮素对氟离子的识别过程是： 氟离子的加入破坏或减弱了体系原有的氢键，促进了槲皮素分子内电荷转移，使槲皮素的荧光强度降低[14]。

图7 槲皮素-氟离子体系(a)和槲皮素(b)的氢谱

表1 槲皮素和槲皮素-氟离子体系中氢原子的化学位移

表2 槲皮素作为荧光探针对DMSO溶液中氟离子的测定

2.5 样品中氟离子的测定

配制浓度为1×10-5mol·L-1的槲皮素DMSO溶液，并分别配制浓度为1.0×10-3，2.2×10-3和3.0×10-3mol·L-1的四丁基氟化铵DMSO溶液。取2 mL槲皮素溶液，向其中加入5 μL 四丁基氟化铵溶液，使最终溶液中氟离子浓度为2.5×10-6，5.5×10-6和7.5×10-6mol·L-1，充分混匀后测定荧光强度，结果如表2所示。由表2可知，该法测量氟离子的精确度较好，回收率分别为102.44%，100.67%和100.95%，可以用来检测样品中的氟离子。

3 结 论

实验发现槲皮素作为荧光探针对氟离子具有较好的选择性。由于氟离子的加入破坏了槲皮素DMSO溶液的氢键，促使槲皮素分子内的电荷重新分配，发生荧光猝灭。由荧光滴定光谱得到氟离子的滴定曲线，该曲线线性关系良好，可以用于对微量氟离子的定量检测。该方法有望应用于生物体内和环境中氟离子的检测。

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(Received Oct. 18, 2015; accepted Jan. 29, 2016)

*Corresponding author

A Quercetin-Based Fluorescent Probe for the Recognition of Fluorid Ions

YANG Shi-long1, 2, JIANG Wei-na1, 2, YIN Bin3, XU Li2, 3, 4*, ZHAO Feng-yi2, 5, GAO Bu-hong4, SUN Hai-jun4,DU Li-ting4, TANG Ying4, 5, CAO Fu-liang2, 5

1. College of Chemical Engineering, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China 2. Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China 3. College of Science, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China 4. Advanced Analysis and Testing Center, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China 5. College of Forestry, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China

Quercetin；Fluorescent sensor; Fluorid ions; Anions; Natural product

2015-10-18，

2016-01-29

国家林业局林业公益性行业科研专项项目(20120460102), 江苏省第四期“333高层次人才培养工程”科研项目(BRA2012171), 国家科技支撑计划课题项目(2012BAD21B04)和南京林业大学优秀博士学位论文创新基金项目资助

杨世龙，1989年生，南京林业大学博士研究生 e-mail: yshl6072@163.com *通讯联系人 e-mail： xuliqby@njfu.edu.cn

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)11-3582-06