基于454高通量测序平台血液、呼吸道、消化道临床样本的快速检测

韩 娜强裕俊张婷婷苗娇娇张 雯*（1 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所生物信息室，北京 102206；2 感染性疾病诊治协同创新中心，浙江 杭州 310003）



基于454高通量测序平台血液、呼吸道、消化道临床样本的快速检测

韩 娜1，2强裕俊1，2张婷婷1，2苗娇娇1，2张 雯1，2*
（1 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所生物信息室，北京 102206；2 感染性疾病诊治协同创新中心，浙江 杭州 310003）

【摘要】目的 探讨454高通量测序平台应用于临床样本快速检测的可能性。方法 应用454高通量测序平台测定血液、呼吸道和消化道临床样本中微生物菌群的16S rDNA基因的V3-V4高变异区段序列，采用BLAST方法与RDP数据库进行比对，基于比对结果，获得不同种属的病原菌的所匹配的read数。结果 8份临床模拟样本中，7份检测出目标菌属，检出率为87.5%。在血液、肺泡灌洗液和咽拭子这类正常状态下的无菌体液，检测结果较为明确，检出的细菌较为集中，显示了检测结果的可靠性。而对本身含有较多种类细菌的粪便样本，其目标菌比例明显降低。结论 实现了80 h内得到血液、呼吸道和消化道临床样本中含有病原菌情况的检测报告，并探讨了高通量测序技术在今后临床实际应用时进一步提高检测速度和灵敏度的方法。

【关键词】454高通量测序；临床样本；病原菌；检测

16S rRNA位于原核细胞核糖体小亚基上，包括10个保守区域（conversed regions）和9个高变区域（hypervariable regions），其中保守区在细菌间差异不大，高变区具有属或种的特异性，随亲缘关系不同而有一定的差异［1］。因此，16S rRNA可以作为揭示生物物种的特征核酸序列，被认为是最适于细菌系统发育和分类鉴定的指标［2］。然而16SrRNA的检测前提是需要病原的分离培养。虽然人们已通过实验室培养分离并保存了部分稳定的菌株，但实际上目前仅有上千种（Species水平）的微生物基因组获得了成功测序；99%的环境微生物，尤其以厌氧和极端环境生存菌，仍无法分离纯化而实现实验室培养或尚未成功建立培养体系［3］。由于技术有限性导致对大量微生物表型、遗传信息的认知局限性，大大限制了我们对这些未知菌种的研发和利用，也限制了我们进一步解析微生物和人类健康间的关联性。

近年来随着高通量测序平台和技术的不断革新，宏基因组研究，不依赖于培养技术，以整个微生物群落遗传物质为研究对象，大力推动了整个微生物群落的结构和功能基因组学研究的迅速发展，促使人们不断深入了解这些微生物群落的结构、功能、进化以及群落间，群落与环境间的相互作用关系，以及微生物和人类健康间的关联性［4-5］。本课题组在前期的工作中，也利用宏基因组学方法（16S Meta）探索了人类肠道的菌群结构变化和儿童腹泻、糖尿病等多种疾病之间的关联性［6-7］。然而目前仍缺乏基于16s rDNA的未知病原菌高通量筛查技术，如何利用宏基因组技术从患者身上快速检测出病原菌仍是传染病工作目前发展的技术难题。在本研究中，本课题组利用454测序平台，对血液、呼吸道和消化道的临床模拟样本进行了16S rDNA宏基因组测序，基于测序结果进行了未知病原检测，实现了80 h内完成8份模拟临床样本的检测，对探索高通量测序方法在临床检测方面的应用做出了一定的贡献。

1 资料与方法

1.1 样本准备：收集8份健康人的样本，分别为灌洗液、咽拭子、血液和粪便，分别添加8种不同的病原菌（表1），浓度为～104ccfu/g。

1.2 核酸提取：8份模拟样本的核酸提取是利用Qiagen UCP Pathogen Mini Kit试剂盒。提取方法详细如下：加40 μL Proteinase K，涡旋器混合样本10 s；56 ℃孵化10 min；加200 μL Buffer APL2到样本，盖上盖子，多脉冲涡旋器震荡混合30 s；70 ℃孵化10 min；瞬时离心，将盖子上的液体滴落；加300 μL乙醇到裂解液中，盖上盖子，多脉冲震荡漩涡器震荡15～30 s混合均匀；加混合物到QIAamp UCP Mini spin column柱子上，6000×g（8000 rpm）离心1 min；小心打开离心柱，加600 μL Buffer APW1，避免污染柱子边缘，6000×g（8000 rpm）离心1 min；加750 mL Buffer APW2，全速（20000×g，14000 rpm）离心3 min；将离心柱放置到新的2 mL收集管中，弃置含废液的收集管。全速离心1 min；将离心柱放置到新的2 mL收集管中，打开盖子，56 ℃孵化整个装置3 min，将膜彻底干燥；将离心柱放置到新的1.5 mL洗脱管中，弃置收集管，小心加20～100 μL Buffer AVE到离心柱的中央。盖上盖子，室温静止1 min；全速离心（20000×g，14000 rpm）1 min，洗脱DNA。

表1 8份模拟样本的详细信息。

1.3 高通量测序：基于454测序平台进行测序，按照454 Junior测序平台标准操作手册进行。工作流程见图1。

1.4 数据分析：测序序结果，利用FastQC进行质量控制。剔除低质量序列后，我们采用BLAST方法与RDP数据库进行比对，基于比对结果，获得不同种属的病原菌的所匹配的read数。

2 结 果

2015年10月13日9：00实验室取样，依次进行核酸提取、16S扩增、建库、油包水实验、测序和数据分析步骤（如图1所示），于10月16日17：35生成鉴定报告，总工作时间80 h。所需人力3名，其中实验室人员2名，数据分析人员1名。

样本一为肺泡灌洗液模拟样本，测序序列数（read）为773。经过与RDP数据库比对，有458条序列与军团菌属匹配，比例为59.64%。通过与16S数据库比对，有348条序列与目标菌嗜肺军团菌匹配，比例为45.44%。检测结果为阳性。

表2 8份临床模拟样本的检测结果

图1 工作流程及时间

样本二为咽拭子模拟样本，测序序列数（read）为10376。经过与RDP数据库比对，有9725条序列与不动杆菌属匹配，比例为94.07%。通过与16S数据库比对，有348条序列与目标菌不动杆菌属匹配，比例为42.88%。检测结果属水平上为阳性。

样本三为血液模拟样本，测序序列数（read）为1279。经过与RDP数据库比对，有1006条序列与李斯特菌属匹配，比例为78.66%。通过与16S数据库比对，有915条序列与目标菌李斯特菌属匹配，比例为71.54%。检测结果属水平上为阳性。

样本四为粪便模拟样本，测序序列数（read）为3262。经过与RDP数据库和16S数据库比对，皆无序列与空肠弯曲菌匹配。检测结果为阴性。

样本五为粪便模拟样本，测序序列数（read）为7375。经过与RDP数据库比对，有1425条序列与弧菌属匹配，比例为19.42%。通过与16S数据库比对，有384条序列与目标菌副溶血弧菌匹配，比例为5.23%。检测结果为阳性。

样本六为粪便模拟样本，测序序列数（read）为7464。经过与RDP数据库比对，有81条序列与弧菌属匹配，比例为1.09%。通过与16S数据库比对，有4条序列与目标菌弧菌属匹配，比例为0.06%。检测结果属水平上为阳性。

样本七为粪便模拟样本，测序序列数（read）为425。经过与RDP数据库比对，有150条序列与沙门菌属匹配，比例为36.08%。通过与16S数据库比对，有107条序列与目标菌肠道沙门菌匹配，比例为25.18%。检测结果为阳性。

样本八为粪便模拟样本，测序序列数（read）为1484。经过与RDP数据库比对，有1条序列与气单胞菌属匹配，比例为0.07%。通过与16S数据库比对，有2条序列与目标菌嗜水气单胞菌匹配，比例为0.13%。检测结果为阳性。

8份临床模拟样本中，7份检测出目标菌属，检出率为87.5%。详细检测结果请见表2。

3 讨 论

目前临床上，常规培养、生化血清学鉴定方法仍是主流的检测方法，但存在检出率低和漏检率高的缺点。基于特异序列的PCR方法灵敏度高、检测速度快，但只能针对一种或几种特定的菌进行鉴定，不利于用于未知病原的筛查。高通量测序检测方法由于其数据量大，不依赖于细菌培养，一经面世就被寄予了解决未知病原检测问题的厚望，本研究模拟临床实战，从样本接受到返回报告，实现了80 h内的得到检测报告，检出率高达87.5%，具有较高的敏感性。然而目前的实验的样本数还较少，其敏感性和特异性还需要大数据量的进一步的验证。此外，本次实验也反映出了一些问题。

首先，检测时间需要80 h，从临床应急的角度仍需进一步的压缩。为解决以上问题，我们计划采取硬件和软件一起优化的策略。在硬件上，升级测序平台，改用测序时间更短的新一代测序仪；在软件上，实现人员的合理配置，从现在的单班8小时工作优化为双组轮班制，以最大可能的压缩闲置时间。

其次，目前的检测结果显示在血液、肺泡灌洗液和咽拭子这类正常状态下的无菌体液，检测结果较为明确，检出的细菌较为集中，目标菌比例超过50%，最高超过94%，显示了检测结果的可靠性。而对本身含有较多种类细菌的粪便样本，其目标菌比例明显降低。这提示了我们未来在对有菌体液，如粪便样本的检测中，需要提高测序数据量，以尽可能覆盖目标菌群，提高检测的阳性率。

最后，目前的检测结果仍局限于属水平上，在种水平上由于目前的16S数据库数据量较小的原因，很多病原菌在种水平上不能检出。因此，我们需要针对常见的病原菌扩增16S全长，补充到我们目前的数据库中，以提高检测精确度。

综上所述，454高通量测序平台可用于临床样本的快速检测，且

中图分类号：R446

文献标识码：B

文章编号：1671-8194（2016）17-0039-03

基金项目：国家自然科学基金青年基金（课题编号81201322）和国家高技术研究发展计划课题（2014AA021505）

*通讯作者：E-mail：Zhangwen@icdc.cn