兰州方对再生障碍性贫血模型小鼠淋巴细胞亚群和脾脏组织的影响*

黄邦荣，展　锐，倪　红，杨佳华，王兰英，张永萍，梁　曦

(甘肃省中医院肿瘤血液科，甘肃 兰州 730050)



·实验研究·

兰州方对再生障碍性贫血模型小鼠淋巴细胞亚群和脾脏组织的影响*

黄邦荣，展锐，倪红，杨佳华，王兰英，张永萍，梁曦

(甘肃省中医院肿瘤血液科，甘肃 兰州 730050)

摘要目的：观察兰州方对再生障碍性贫血模型小鼠淋巴细胞亚群和脾脏组织的影响。方法：将90只BALB/C小鼠，随机分为兰州方大、中、小剂量组，贞芪扶正颗粒组，模型对照组和正常对照组，每组15只。造模成功后第8天起，兰州方大、中、小剂量组分别予以0.02，0.01，0.005 g/(g·d)药液(当于成人用量的40,20,10倍)灌胃；贞芪扶正颗粒组予以0.01 g/(g·d)(相当于成人临床用量的20倍)灌胃；正常对照组、模型对照组给予等量生理盐水灌胃，连续40 d。脱颈处死小鼠，无菌条件下剖腹取出脾脏，采用免疫组化法测CD4+、CD8+含量及CD4+/CD8+的值，并观察各组脾脏病理组织学变化。结果：兰州方能使脾脏CD4+含量呈增高趋势、CD8+含量呈降低趋势，同时提高CD4+/CD8+值；兰州方可减轻模型小鼠脾脏病理学改变，明显降低脾脏淋巴细胞的凋亡率, 促进生发中心恢复。结论：兰州方能调节机体紊乱的免疫状态，提高CD4+、降低CD8+的数量和活性,调整CD4+/CD8+值,对再障小鼠脾脏组织有显著改善作用。

关键词再生障碍性贫血； 兰州方； 淋巴细胞亚群；脾脏组织；动物；小鼠

再生障碍性贫血属中医学“血虚”“血证”“虚劳”“虚损”及“血枯”等范畴。中医学认为：血与气、血与精的关系密切。气属阳，血属阴，血液的生成有赖于气，气可生血，血可化气，精血互化。精系生命之根本，闭藏于肾中，肾精生髓，精髓能化生血液。全国著名中西医结合专家裴正学教授认为:健脾补肾是治疗再生障碍性贫血的根本大法。兰州方是在此理论基础上根据多年临床经验研制而成，具有补肾生髓、健脾益气、养血和胃功效，临床治疗再生障碍性贫血、调整机体免疫功能收效良好。为进一步研究中医健脾补肾理论治疗再障的作用机制，本研究观察了兰州方对再障模型小鼠淋巴细胞亚群和脾脏组织的影响。

1材料与方法

1.1动物

健康BALB/C小鼠90只，雌雄各半，体质量(20±2g), 8～10周龄，DBA/2小鼠10只，雌雄各半，8周龄[1]，由甘肃省医学科学研究院实验动物中心提供，动物合格证号：医动字第14-009号。

1.2药品与仪器

兰州方由生地黄、山茱萸、山药、牡丹皮、北沙参、人参须、潞党参、太子参、桂枝、浮小麦、大枣、麦冬、五味子、炙甘草、白芍、墓头回等组成，由甘肃省兰州市荟萃堂制成颗粒冲剂，每包含生药量36.25 g；贞芪扶正颗粒，由佛慈制药有限公司提供，生产批号 Z62020416。 直线加速器，德国西门子Primus产品；VS-1300L型超净工作台，苏净集团 苏州安泰空气技术有限责任公司产品；BCD-213型低温冰箱，青岛海尔股份有限公司产品；PHY-Ⅲ型病理组织漂烘处理仪、CM1900HE染色仪、BMJ-Ⅲ型包埋机，均为常州中威电子仪器厂产品；BP211D型电子天平，瑞士Sartorius公司产品。

1.3腺淋巴结细胞悬液制备

取DBA/2小鼠断颈处死，用750 mL/L酒精浸泡5 min，常规消毒；无菌下取出胸腺及颈部、颌下、腋窝、腹股沟、肠系膜等处淋巴结；加少量生理盐水，轻轻剪碎、碾碎，用200目尼龙网过滤；通过4#针头使其成单细胞悬液；台盼蓝鉴定细胞活性，活性细胞达95%以上[2]。

1.4分组与模型的建立

将动物随机分为正常对照组，模型对照组，兰州方大、中、小剂量组，贞芪扶正颗粒组，每组15只。

造模方法参照姚军等[3]再障造模和赵忻等[4]关于免疫介导小鼠再障模型方法改进。除正常对照组外，将其余75只BALB/C小鼠经直线加速器6Mv γ射线全身照射，照射高度100 cm，时间1 min，剂量3.0GY。照射4 h内经尾静脉输入取自DBA/2小鼠胸腺淋巴结细胞悬液0.2 mL，细胞数1×106/只[5]。造模1周后，血常规、骨髓涂片检测造模是否成功。血常规：经尾静脉采血，结果示模型组与正常对照组对比,白细胞、血小板、血红蛋白均明显下降(P<0.01),见表1。 骨髓涂片：每组随机取5只小鼠，脱颈处死后取出左侧股骨,用4号针头取1 mL RPMI-1640液冲出骨髓,滴于载玻片上推片，HE染色,在光学显微镜下进行骨髓组织形态学观察[6]。结果显示造模组小鼠骨髓增生低下，粒系平均<15%、红系<7%、巨核细胞0～7个/HP；正常对照组骨髓增生活跃，粒系平均>40%、红系平均>14%、巨核细胞45～72个/HP；两组对比，差别有统计学意义(P<0.05)。以上结果证实:本实验所复制的免疫介导型再障小鼠模型是成功的[7]，可以按原方案进行后期实验。

注：与正常对照组对比，*P<0.05,**P<0.01。

1.5给药方法

造模成功后第8天起，各组开始灌胃。兰州方颗粒、贞芪扶正颗粒临用前分别用蒸馏水充分溶解，根据文献中人/小鼠用药等效剂量换算法，中药中剂量组相当于成人临床用量的20倍[8]。兰州方大、中、小剂量组分别予以0.02，0.01，0.005 g/(g·d)药液(相当于成人用量的40,20,10倍)灌胃,贞芪扶正颗粒组每只0.01 g/(g·d)(相当于成人临床用量的20倍)灌胃，正常对照组、模型对照组给予等量生理盐水灌胃，连续40 d[9]。灌胃期间，各组均以普通饲料喂养。

1.6检测指标

1.6.1T淋巴细胞亚群测定

参照文献[10]方法进行。免疫组化染色步骤[11]如下：① 石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS液(pH值7.5±0.1)冲洗3次，每次3 min； ② 根据单克隆抗体的要求，加1 mL EDTA修复液(pH值8.0)，对组织抗原进行修复；③ 每张切片加1滴过氧化酶阻断溶液，室温下孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶的活性，PBS液冲洗3次，每次3 min；④ 除去PBS液，每张切片加1滴正常非免疫动物血清，室温下孵育10 min；⑤ 除去动物血清，每张切片加第一抗体，室温下孵育60 min；⑥ PBS液冲洗3次，每次5 min，除去PBS液，每张切片加1滴生物素标记的第二抗体KT-9707-c，Biotin-conjugated second Antibody(Rabbit)，室温下孵育10 min，PBS液冲洗3次，每次3 min；⑦ 除去PBS液，每张切片加1滴链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，室温下孵育10 min，PBS冲洗3次，每次3 min；⑧ 除去PBS液，每张切片加2滴新鲜配制的DAB溶液，镜下观察3～10 min；⑨ 自来水冲洗，苏木素复染，PBS液冲洗返蓝；⑩ DAB显色，所有切片经过梯度酒精逐级脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。过氧化物酶-抗过氧化物酶法，最终反应产物呈棕色，切片经图像分析软件处理后，根据平均光密度值及目标面积比得出阳性细胞所占百分数。

1.6.2脾脏组织病理学变化

灌胃结束，脱颈处死小鼠；无菌条件下剖腹取出脾脏，用40 g/L甲醛溶液固定；用体积分数递减的无水乙醇逐级脱水干燥，二甲苯透明，石蜡包埋,将每份标本制成4 μm厚度的组织切片，每例标本连续切制3片；脱蜡后分别进行HE染色；在光学显微镜下进行脾脏形态学观察。

1.7统计学方法

2结果

2.1各组小鼠T淋巴细胞亚群含量对比

与正常对照组对比，模型对照组小鼠CD4+值下降，CD8+值升高，CD4+/CD8+降低,差别有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组对比，兰州方中、小剂量组的CD4+值升高，CD8+值降低，差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；而兰州方大剂量组、贞芪扶正颗粒组CD4+升高、CD8+降低作用不显著，CD4+/CD8+仅略升高，差别无统计学意义(P>0.05)。见表2。

注:与正常对照组对比，*P>0.05,**P<0.05，***P<0.01；与模型对照组对比，#P>0.05， ##P<0.05，###P<0.01。

2.2各组小鼠脾脏组织病理学情况对比

模型对照组脾脏体积缩小,质量减轻,色淡红,脾被膜增厚,切片未见髓外造血, 脾小体萎缩,数目减少,脾组织结构疏松,脾血窦扩张,但不充血,呈贫血状,部分区域可见脾小动脉壁增厚及玻璃样变。兰州方中剂量组白髓面积可占50%～70%，生发中心恢复良好，扩张的血窦基本恢复正常，呈充血状态。小剂量组和贞芪扶正颗粒组白髓面积、脾小体数量、生发中心、被膜和血窦均不同程度恢复。大剂量组则恢复较慢，仅比模型对照组略优。小鼠脾脏病理切片见图1～12。

3讨论

大量研究表明，再障患者存在T淋巴细胞亚群失衡。CD8+细胞异常激活,导致抑制性细胞因子如IL-2、IFN-γ、TNF-α等分泌异常增多[12]，协同对造血起负调控作用，导致造血干和(或)祖细胞增殖、分化缺陷[13]。IL-2、TNF-α、IFN-γ 等细胞因子不仅能直接抑制造血细胞的增殖[14]，而且还可通过Fas抗原(CD95)介导的细胞凋亡，诱导CD34细胞的程序性死亡，从而导致造血衰竭[15]。

本研究表明，兰州方可使再障模型小鼠脾脏CD4+含量呈增高趋势、CD8+含量呈降低趋势，同时调整CD4+/CD8+值，具有免疫调节作用。小鼠脾脏病理组织切片观察表明，兰州方可减轻再障模型小鼠脾脏病理学改变，降低淋巴细胞的凋亡率，促进生发中心的恢复，使白髓面积扩大，被膜变薄，扩张的血窦基本恢复正常。兰州方大剂量组作用不明显，考虑与中药剂量过大，超过小鼠胃肠之负荷，导致一系列功能紊乱，同时中药剂量过大亦会产生一定毒副作用，提示我们在临床用药时应把握中药的剂量，尤其对小儿患者，更应谨慎用药。

4参考文献

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(编辑陶珠)

文章编号:1001-6910(2016)01-0054-05

中图分类号:R556.5

文献标志码:B

doi:10.3969/j.issn.1001-6910.2016.01.25

作者简介

黄邦荣(1979—)，男(汉族)，甘肃民勤人，硕士，副主任医师，主要从事肿瘤及血液病的中西医结合诊疗工作。

* 基金项目：甘肃省中医药科学技术研究课题(GZK-2012-23)

收稿日期：2015-02-08；修回日期：2015-09-09