骨关节炎患者关节软骨细胞合成和分解基因的表达研究
2016-07-10陈颖娟黄慈波牛素平张亚军杨昕
陈颖娟 黄慈波 牛素平 张亚军 杨昕
【摘 要】目的:初步探讨合成和分解相关基因Ⅱ型胶原a1(COL2A1)、聚蛋白多糖(ACAN)、含Ⅰ型血小板结合蛋白基序结构的去整合素金属蛋白酶-5(ADAMTs-5)、基质金属蛋白酶组织抑制剂-3(TIMP-3)在骨关节炎患者关节软骨细胞和外周血的表达水平。方法:入选行关节置换术的骨关节炎患者3例、类风湿关节炎患者3例和创伤截肢患者4例,分成骨关节炎组、类风湿关节炎组和创伤对照组,分别取离体关节软骨标本体外培养软骨细胞;入选骨关节炎患者9例、类风湿关节炎患者10例
和健康对照者10例,分成骨关节炎组、类风湿关节炎组和正常对照组,分别抽取4 mL外周静脉血提取外周血单个核细胞,利用实时荧光定量聚合酶链反应法(RT-PCR)检测关节软骨细胞和外周血单个核细胞COL2A1、ACAN、ADAMTs-5、TIMP-3基因表达。采用非配对资料t检验比较各基因分别在关节软骨细胞、外周血单个核细胞表达的组间差异。结果:骨关节炎组与创伤对照组组间比较提示ACAN、TIMP-3、COL2A1基因在骨关节炎关节软骨细胞表达下调,ADAMTs-5基因表达上调,TIMP-3表达低于创伤对照组(P < 0.05);各基因在骨关节炎外周血单个核细胞表达无统计学意义(P > 0.05)。结论:TIMP-3、COL2A1、ACAN和ADAMTs-5基因在关节软骨细胞中的异常表达趋势对骨关节炎发生发展有预警作用,在外周血的表达无特异性。
【关键词】 骨关节炎;软骨细胞;基因
【ABSTRACT】Objective:To study the expression level of synthesis and decomposition genes such as COL2A1,ACAN,ADAMTs-5 and TIMP-3 in articular cartilage cells and peripheral blood.Methods:There were three selected groups:an osteoarthritis group (3 cases for joint replacement),a rheumatoid arthritis group (3 cases with rheumatoid arthritis) and a trauma control group (4 cases of amputation due to trauma).Cartilage specimens in vitro were taken to culture chondrocytes.In addition,Peripheral blood mononuclear cells were obtained from 4 mL peripheral vein blood taken from the other three groups:an osteoarthritis group (9 cases with osteoarthritis),a rheumatoid arthritis group (10 cases with rheumatoid arthritis) and a health control group (10 healthy people).RT-PCR method was used to detect the gene expressions of COL2A1,ACAN,ADAMTs-5 and TIMP-3
in articular cartilage cells and peripheral blood.Non-pairing data t was used to test and compare the expression differences of genes in articular chondrocytes and peripheral blood mononuclear cells.Results:The comparison between the osteoarthritis group and the trauma control group suggested that the expression of ACAN,TIMP-3 and COL2A1 had a down regulation in osteoarthritic articular cartilage cells,the expression of ADAMTS-5 was up-regulated,and the expression of TIMP-3 was lower than that of the trauma control group (P < 0.05).The expression of each gene in peripheral blood mononuclear cells was not statistically significant (P > 0.05).Conclusion:The abnormal expression of TIMP-3,COL2A1,ACAN and ADAMTs-5 in articular chondrocytes has a warning effect on the occurrence and development of osteoarthritis but no specificity in peripheral blood.
【Keywords】 osteoarthritis;chondrocyte;gene
骨关节炎(osteoarthritis,OA)是老年人最常见的关节疾病,诊断依赖于临床症状和影像学,缺乏有效的早期诊断生物标志,不利于早期防治[1-2]。寻找与关节软骨病变呈“镜像”关系的生物标志具有重要意义[3]。OA发病机制目前尚不明确。软骨细胞合成和分解代谢功能失衡是OA核心事件。关节软骨细胞合成Ⅱ型胶原、聚蛋白多糖下降,蛋白水解酶活性增高,内源性蛋白水解酶活性降低是启动恶性循环的重要环节。选取Ⅱ型胶原a1(COL2A1)、聚蛋白多糖(ACAN)、含Ⅰ型血小板结合蛋白基序结构的去整合素金属蛋白酶-5(ADAMTs-5)、基质金属蛋白酶组织抑制剂-3(TIMP-3)基因构成一个相互关联的整体,能够早期评估和预警OA关节软骨细胞合成和分解代谢功能失衡。临床上关节软骨标本取材不易,故笔者同时探讨上述关联基因在OA外周血中是否存在特异性表达,能否作为OA预警基因在简便易获取的外周血中亦具有生物学标志作用。本研究拟选相关基因COL2A1、ACAN、ADAMTs-5和TIMP-3,采用Real-time PCR技术验证在OA关节软骨细胞和外周血中的表达,以明确其早期预警意义。
1 资料和方法
1.1 标本来源
1.1.1 关节软骨标本 选取2009年2月至2009年
8月在北京大学第一医院和武警北京总队第二医院骨科因OA或类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)行关节置换术、因创伤截肢的住院患者。OA患者3例,男2例,女1例;中位年龄60.5岁;诊断符合1986年美国风湿病学会原发性OA分类标准。RA患者3例,男1例,女2例;中位年龄69岁;诊断符合1987年美国风湿病学会RA标准。创伤截肢患者4例,均为男性;中位年龄34岁;无关节炎病史。研究分成OA组、RA组和创伤对照组。
1.1.2 外周血单个核细胞 选取2010年10月至2011年10月在北京医院风湿免疫科就诊的住院和门诊患者,以及健康体检者。OA患者9例,男3例,
女6例;中位年龄46岁。RA患者10例,男3例,女7例;中位年龄57.5岁。健康查体10例,男3例,
女7例;中位年龄21岁。研究分成OA组、RA组和正常对照组。
1.2 研究方法
1.2.1 关节软骨细胞培养和总RNA提取 Trizol一步法提取原代培养关节软骨细胞总RNA,过柱纯化,分光光度计定量,甲醛变性胶电泳质检。
1.2.2 外周血单个核细胞分离和总RNA提取 分别抽取入选者4 mL静脉血,EDTA抗凝,Ficoll密度离心法分离单个核细胞,总RNA提取和质检步骤同前。
1.2.3 荧光定量PCR法对所选4个目的基因及
1个内参基因进行相对定量分析 ①引物设计:根据Gene Bank基因序列分别设计引物。COL2A1(Forwardprimer:5 AGACCTTCGGGTCAAGGCAGAG3,Reverseprimer:5 CCATTGTGTAGGACACACACAGTTCC 3)、ACAN(Forwardprimer:5TCGGAACCGCAGCTGAATGTAT 3,Reverseprimer:5GGTCCCTCTGATGGCTCTCTCC 3)、ADAMTs5(Forwardprimer:5 CCCTCAATTTTCCAGAAGCAATGG 3,Reverseprimer:5 TTTGAAGGTTGCCAAAGCTGAGA 3) 、TIMP-3(Forwardprimer:5 GTCACTCGGCCCTGGGTAGTCT 3,Reverseprimer:5AGAGATGCCCAAAGGAGGAAGC 3)。②荧光定量PCR反应体系:ddH2O 5 μL,2XSYBR(Qiagen QuantiTech) 10 μL,引物(2 μM)3 μL,模板(cDNA)2 μL,总量 20 μL。
③管家基因GAPDH作为内参照。④荧光定量PCR反应程序:95 ℃ 2 min→40个循环×[94 ℃ 15 s → 60 ℃1 min(数据采集)]→95 ℃15 s →60 ℃1 min →95 ℃ 15 s →60 ℃ 15 s。⑤染色信号收集和资料分析:构建标准曲线,测定目的基因循环阈值,最终计算目的基因相对表达量。
1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行统计分析。计量资料以表示,组间比较采用非配对资料t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 关节软骨细胞和外周血单个核细胞提取的总RNA质量检测合格 总RNA吸光度A260/A280均在1.9~2.1,甲醛变性胶电泳见电泳条带清晰。
2.2 3组关节软骨细胞各基因的表达比较 OA组与创伤对照组比较,OA组ACAN、TIMP-3、COL2A1基因呈下调表达趋势,ADAMTs-5基因呈上调表达趋势,TIMP-3表达低于创伤对照组
(P = 0.029);ACAN、ADAMTs-5和COL2A1表达量组间比较,差异无统计学意义(P > 0.05)。见表1、图1。
2.3 3组外周血单个核细胞各基因的表达比较 经组间各候选预警基因在OA外周血单个核细胞表达比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、图2。
3 讨 论
在力学和生物学等多因素共同作用下,OA软骨细胞、细胞外基质(ECM)及软骨下骨三者降解和合成正常偶联失衡,导致不可逆病变[4]。COL2A1、ACAN、ADAMTs-5、TIMP-3作为预警基因参与一系列相互关联的基因事件,明确上述基因的表达特点,有利于早期监测和诊治。
正常人关节软骨主要由软骨细胞和ECM组成。软骨细胞具有合成和分解代谢ECM功能;ECM合成和降解处于动态平衡,维持软骨细胞内环境和结构的稳定。ECM主要成分是聚蛋白多糖与胶原网络,通过基质金属蛋白酶(MMPs)和ADAMTs的分化和互补而被降解[2]。Ⅱ型胶原是软骨的基本结构,早期OA患者胶原代谢标志物的变化,提示Ⅱ型胶原降解增加。聚蛋白多糖在软骨细胞间信息传递、维持细胞表型及与其他基质相互作用方面发挥生物学功能。聚蛋白多糖的进行性丧失是OA的特点,聚蛋白多糖酶活性增高是启动病变的关键酶之一[5]。聚蛋白多糖酶-2即ADAMTs-5,最初从白细胞介素(IL)-1诱导的牛鼻软骨中提取,是OA早期主要的蛋白聚糖降解酶。抑制ADAMTs-5可阻止OA软骨聚蛋白多糖降解,防止软骨退行性变[6]。人TIMP-3的重组N末端抑制序列可抑制ADAMTs-4和ADAMTs-5,其抑制常数(Ki值)低于纳摩尔,明显小于对MMPs抑制所需浓度,表明TIMP-3是ADAMTs-5强大内源性抑制剂[7]。TIMP-3具有成为新治疗靶标的
潜能[8]。
OA软骨处于重建或修复状态,ECM降解一旦启动一系列事件将序贯发生[9-10]。蛋白水解酶活性增高是早期病变的基本步骤,关键第一步是ADAMTs-5介导软骨聚蛋白多糖丢失,多种MMPs持续降解ECM主要成分,引起软骨细胞分解产物释放入滑膜液导致滑膜炎症,被刺激的滑膜释放炎症介质,关节腔炎症细胞聚集,分泌IL-1和肿瘤坏死因子-α(TNF-α),抑制TIMPs表达。恶性循环导致软骨细胞蛋白水解酶表达进一步上调。最终,OA关节软骨ECM、MMPs、ADAMTs、TIMPs形成一个特异性循环模式,结局为蛋白水解酶显著增多、软骨破坏加速直至关节畸形。参与软骨细胞这一循环模式的主要基因COL2A1、ACAN、ADAMTs-5、TIMP-3对OA病变起预警调控作用,针对预警基因的靶向治疗将成为打破这一特异模式的突破点[11-13]。
本研究初步尝试将COL2A1、ACAN、TIMP-3
和ADAMTs-5基因的异常表达作为一个恶性循环整体来探讨对OA的预警。结果表明,ACAN、TIMP-3、COL2A1基因在OA关节软骨细胞表达呈下调趋势,ADAMTs-5表达呈上调趋势,TIMP-3表达显著低于创伤对照组(P < 0.05);但各预警基因在OA外周血单个核细胞表达无特异性。已知中老年RA为继发性OA,在关节软骨退行性变的基础上,存在复杂的免疫炎症背景。本研究设立RA组,结果提示,4个基因在RA组和OA组表达趋势相同,差异无统计学意义(P > 0.05)。是否提示OA与RA在关节软骨发病机制上有一定程度交叉?上述4个基因是否对促使OA炎症持续进展亦具有预警?有待明确。由于关节软骨取材不易,研究样本量小,笔者观察到OA关节软骨细胞ACAN、TIMP-3、COL2A1和ADAMTs-5基因的异常表达趋势,提示作为相互关联的基因表达可早期评估和预警OA关节软骨细胞合成和分解代谢功能失衡。但上述基因在OA外周血的表达不具有特异性,能否在简便易获取的外周血中作为OA预警基因广泛应用,仍需进一步探讨。推测原因:基因的表达可能受DNA甲基化调控,而RT-PCR检测技术存在局限性,不排除采用DNA甲基化研究能证实上述预警基因OA外周血表达调控具有特异性,故仍可作为候选基因,需进一步证实。
本研究不足之处是小样本体外实验,结果不一定完全代表疾病的发展规律。今后可进一步深入研究的方向包括:增加病例样本,在性别匹配基础上进行OA年龄分层研究(60岁以上和以下);因影响疾病的最终物质是蛋白类物质,增加与OA预警基因对应的蛋白类指标,研究基因与蛋白的变化关系,在蛋白水平探讨OA软骨细胞合成和分解代谢功能的失衡。
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收稿日期:2016-01-20;修回日期:2016-03-02