鱼胆草中獐牙菜苦苷提取工艺条件的优化

2016-07-10杨富茗何珺马海霞吴兆喜

安徽农业科学 2016年5期

杨富茗　何珺　马海霞　吴兆喜

摘要[目的]研究鱼胆草中獐牙菜苦苷超声提取工艺参数。[方法]以鱼胆草中的獐牙菜苦苷提取率为考察指标，先对乙醇浓度、提取时间、料液比和提取温度进行单因素试验，然后用L16（43）正交设计对提取温度、料液比、乙醇浓度进行验证试验。[结果]鱼胆草中獐牙菜苦苷最佳提取工艺为料液比1∶10、提取温度60 ℃、乙醇浓度10%、提取时间10 min，獐牙菜苦苷提取率达88%。[结论]此工艺简单可行、重复性好，为鱼胆草的综合开发、利用提供了理论依据。

关键词鱼胆草；獐牙菜苦苷；超声提取；工艺优化

中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）05-139-03

Abstract[Objective]To optimize the technological parameters of ultrasonic extraction of swertiamarine from Swertia davidii.[Method]With extraction rate of swertiamarine as the index， single factor test was carried out， including ethanol concentration， extraction time， solidliquid ratio and extraction temperature. Then， L16 （43） orthogonal design was conducted to select the extraction temperature， solidliquid ratio and extraction temperature.[Result]The optimal extraction technology of swertiamarine from S. davidii was as follows： 1∶10 solidliquid ratio， 60 ℃ extraction temperature， 10% ethanol concentration， and 10 min extraction time. Under these conditions， the extraction rate of swertiamarine was 88%.[Conclusion]This technology is simple， feasible and repeatable， and provides theoretical foundation for the comprehensive development and utilization of S. davidii.

Key words Swertia davidii ； Swertiamarine ； Ultrasonic extraction； Technological optimization

鱼胆草（Swertia davidii）学名称川东獐牙菜，为土家族民间常用的一种民族药，民间常称之为青鱼胆草、水黄连、水灵芝等，是龙胆科獐牙菜属植物川东獐牙菜的全草，具有清热解毒作用，民间常用于清肺热、活黄疽、恶疮疥癣、急性肠炎、菌痢等症[1]。獐牙菜苦苷（swertiamarine）是鱼胆草中主要的有效成分之一，白色片状结晶，味苦，在空气中略有吸湿性，熔点113～114 ℃，易溶于甲醇、乙醇，不溶于氯仿、石油醚，具有预防缺氧引起的大鼠肝损伤[2]、改善糖尿病性肾病变状况、抗高血脂、抑制微生物及肿瘤细胞等作用[3-5]。目前鱼胆草的文献报道逐渐增多，主要集中在其酚类物质、苷类物质和酸类物质的研究[6-8]，但针对獐牙菜苦苷的提取研究较少[9]。该研究对超声提取鱼胆草中獐牙菜苦苷方法进行考察，采用单因素试验分析乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间对獐牙菜苦苷提取效率的影响，并采用正交试验方法优化参数，确定其最佳提取工艺，以期为獐牙菜苦苷的提取技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

RE52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHBⅢ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；DV215CD分析电子天平（美国奥豪斯）；KQ2200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；GZX9140 MBE 电热鼓风干燥箱（上海博迅事业有限公司）；HH·Sy21Ni6电热恒温水浴锅（北京长源实验设备厂）；Agilent 1100 Series高效液相色谱仪（大连依利特分析仪器有限公司）。

1.2 试材

鱼胆草于2014年由贵州大学农学院任明见教授鉴定并提供。提取原料为鱼胆草全草40 ℃烘24 h，进行粉碎过80目筛制成；獐牙菜苦苷对照品购自上海同田生物技术股份有限公司（批号E0334，纯度≥98.7%）；甲醇为色谱纯；乙醇为分析纯。

1.3 方法

1.3.1

色谱分析条件。色谱柱为Hypersil C18色谱柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相为溶于甲醇∶双蒸水（30∶70）；柱温30 ℃；检测波长254 nm[10]；流速0.8 mL/min；进样量20 μL。

1.3.2 獐牙菜苦苷对照品溶液的制备、样品的处理方法。

1.3.2.1 对照品溶液的制备。准确称取獐牙菜苦苷4.3 mg于100 mL容量瓶中，加入甲醇超声溶解并定容，微滤备用。

1.3.2.2 样品处理。取液体样液用超纯水稀释100倍，微滤后按“1.3.1”色谱条件进行HPLC检测。

1.3.3 方法学考察。

1.3.3.1 系统适应性试验。分别精密吸取对照品和甲醇提取液各20 μL，在“1.3.1”色谱条件下，注入液相色谱仪进行测定，记录色谱图，考察系统适应性。

1.3.3.2 线性关系考察。精密吸取对照品备用液，分别加流动相稀释成0.491 20、0.245 60、0.122 80、0.030 70、0.015 35 mg/mL得到獐牙菜苦苷对照品的系列浓度溶液。按“1.3.1”色谱条件，进样20 μL，测定峰面积，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，计算线性回归方程。

1.3.3.3

精密度试验。精密吸取同一供试品溶液20 μL，重复进样6次，测定其峰面积积分值，计算RSD值，要求小于3%。

1.3.3.4

稳定性试验。分别精密吸取同一供试品溶液20 μL，于0、2、4、8、12、24 h进样，测定其峰面积积分值并计算其RSD值。

1.3.3.5

加样回收试验。精密称取已知含量的同批样品（含量为715.24 mg/g）约0.01 g，共6 份，置容量瓶中，分别精密加入獐牙菜苦苷对照品（0.43 mg/mL）80 mL，然后按“1.3.3.2”含量测定方法制备供试品溶液，并测定含量，计算回收率和RSD值。

1.3.4

样品的含量测定。平行3份称取鱼胆草1.0 g于100 mL容量瓶中，加入甲醇80 mL在50 ℃超声30 min，取出冷却，定容至100 mL[11]，测定獐牙菜苦苷的含量。

1.3.5 单因素试验。

1.3.5.1 乙醇浓度的选择。鱼胆草中的獐牙菜苦苷有效成分极性较大，故用不同比例的水和乙醇的混合液配置不同的极性提取。取鱼胆草5 g，平行4份，30 ℃条件下分别加10%、30%、60%、90%乙醇各40 mL，超声30 min，分别测定獐牙菜苦苷的含量。

1.3.5.2 提取时间的选择。取鱼胆草5 g，平行4份，30 ℃条件下分别加入30%乙醇各40 mL，提取10、20、30、60 min，分别测定獐牙菜苦苷的含量。

1.3.5.3 料液比的选择。取鱼胆草5 g，平行4份，30 ℃条件下分别加溶剂量为药材的4、6、8、10倍量30%乙醇40 mL，提取时间为10 min，分别测定獐牙菜苦苷的含量。

1.3.5.4 提取温度的选择。取鱼胆草5 g，平行4份，提取温度分别为20、30、50、60 ℃，溶剂为30%乙醇40 mL，提取时间为10 min，分别测定獐牙菜苦苷的含量。

1.3.6 正交试验。采用正交试验法对鱼胆草药材的提取工艺条件进行优选。选择乙醇浓度、料液比、提取温度作为考察因素，以鱼胆草中獐牙菜苦苷的提取率为评价指标，采用L16（43）正交表安排试验（表1）。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 系统适应性试验。图1表明，在“1.3.3.1”条件下杂峰干扰小、分离效果佳且检测时间短，便于检测。

2.1.2

线性关系考察。按“1.3.3.2”方法操作，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标得线性回归方程为y=1.630×104x+89.681（r=0.999 7），表明獐牙菜苦苷在0.013 5～0.491 2 mg/mL的范围内呈现良好的线性关系。

2.1.3

精密度试验。按“1.3.3.3”方法操作，计算得出峰面积积分值的RSD为0.43%（n=6）。表明在此试验条件下精密度良好。

2.1.4

稳定性试验。按“1.3.3.4”方法操作，计算得出峰面积积分值的RSD为1.30%（n=6），表明供试品溶液在24 h内峰面积分值基本稳定。

2.1.5

加样回收试验。按“1.3.3.5”方法操作，计算得出平均回收率为98.5%，RSD 为0.95%，表明该方法准确、可靠，可用于鱼胆草中獐牙菜苦苷的含量测定。

2.2 含量的测定

由表2可知，鱼胆草中獐牙菜苦苷的含量平均为3.02%。

2.3 单因素试验

2.3.1 乙醇浓度的选择。由图2可见，随着浓度的增大，鱼胆草中獐牙菜苦苷的提取率先增加后降低，在乙醇浓度为30%时獐牙菜苦苷的提取率最高，故选取最佳乙醇浓度为30%。

2.3.2

提取时间的选择。由图3可见，在提取时间为10～60 min时，鱼胆草中獐牙菜苦苷的提取率变化不大，说明提取时间对提取率的影响不大，综合考虑能耗因素，故确定提取时间为10 min。

2.3.3

料液比的选择。从图4可以看出，随着料液比增大，鱼胆草中獐牙菜苦苷的提取率不断增大，到1∶8时提取率不再显著增加。考虑提取獐牙菜苦苷的同时节省提取液，故选择料液比为1∶8。

2.3.4

提取温度的选择。由图5可知，在提取温度为50 ℃时，鱼胆草中獐牙菜苦苷的提取率最高，故选取50 ℃为提取温度。

2.4 正交试验

从表3可以看出，料液比的极差较大，说明料液比的变化对鱼胆草中獐牙菜苦苷提取率的影响较大，其次是提取温度和乙醇浓度，各因素对提取率影响的大小顺序为料液比（B）>提取温度（C）>乙醇浓度（A）。由方差分析得出，A、C因素均无显著影响，故可任取一个水平，考虑正交试验结果中均值数据兼顾能耗，取A1、C4为佳；B因素对提取率有显著影响，取B4为佳。综上所述，可确定鱼胆草中獐牙菜苦苷超声波提取工艺的最优条件为A1B4C4，即提取时加入乙醇浓度为10%、料液比1∶10、提取温度60 ℃。

2.5 验证试验

取鱼胆草5 g，共3份，按选定的最佳提取方案A1B4C4安排验证试验，分别测定鱼胆草中獐牙菜苦苷的提取率。结果显示（表4），獐牙菜苦苷提取率达88%，且具有较好的重现性，表明此工艺条件稳定可行。

3 结论

该研究采用单因素试验分析乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间对鱼胆草中獐牙菜苦苷提取率的影响，并采用正交试验方法优化参数，确定其最佳提取工艺。结果表明，在提取温度为60 ℃、料液比为1∶10的情况下，用10%乙醇

超声提取10 min，鱼胆草中獐牙菜苦苷提取率达88%；其中料液比对提取率具有显著影响。超声波法提取鱼胆草中獐牙菜苦苷有效成分具有省时、操作简便的优点，为鱼胆草的综合开发、利用奠定了理论依据。

参考文献

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