响应曲面法优化罗伊氏乳杆菌冷冻干燥保护剂的配比

秦鹏　谢鹏　刘广宇　梁宏基　梁淑娃

摘要[目的]提高罗伊氏乳杆菌在冷冻干燥过程中的存活率。[方法]采用响应曲面法，对罗伊氏乳杆菌冻干保护剂中低聚果糖、脱脂乳粉和海藻糖这3种主要成分进行了研究，探讨罗伊氏乳杆菌最优化的冻干保护剂配方。[结果]建立的回归模型达到极显著水平，无失拟因素存在。优化的保护剂配方为：低聚果糖 2.66%、脱脂乳粉10.11%、海藻糖5.90%，冻干存活率达到89.43%，较优化前提高了13.76%。[结论]响应曲面法可用于罗伊氏乳杆菌冷冻干燥保护剂的工艺参数配比优化，为其工业化生产奠定了基础。

关键词 罗伊氏乳杆菌；冻干保护剂；响应曲面法；存活率

中图分类号 TS201.3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）05-006-02

Abstract[Objective]To increase the survival rate of Lactobacillus reuteri after lyophilization.[Method]Response surface methodology was used to investigate the three main components， such as fructooligosaccharide， dried skim milk and trehalose. The optimum formula of lyophilizing protectants for L. reuteri was obtained.[Result]The regression model reached extremely significant level with no factor of lack of fit. The optimized formula was 2.66% fructooligosaccharide， 10.11% dried skim milk and 5.90% trehalose. The survival rate of L. reuteri after lyophilization was 89.43% ， which increased by 13.76%.[Conclusion]Response Surface Method can be used for the optimization of formula of lyophilizing protectants of L. reuteri， which lays foundation for the industrialized production.

Key words Lactobacillus reuteri； Lyophilizing protectants； Response surface method； Survival rate

罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）是普遍存在于人类和大部分动物肠道中的益生菌。它可以代谢产生有机酸、双乙酰、过氧化氢、细菌素及类细菌素等物质[1-2]，能够有效抑制病原菌和腐败菌，维持体内道微生态平衡，且安全无毒副作用，具有耐酸、耐胆盐和肠道定殖等特性。动物试验结果表明罗氏乳杆菌没有安全性方面的问题[3]。目前，罗伊氏乳杆菌已被世界各国批准使用，是国际上公认的新型益生乳酸菌，具有很高的理论研究和生产应用价值[4]。我国卫生部于 2003 年批准了罗伊氏乳杆菌作为人类保健品的微生物菌种。

目前，商品化的罗伊氏乳杆菌制剂，具有较高的细胞存活数量和较高的细胞活力，能更充分地发挥乳酸菌的功能性质[5]，通常使用冷冻干燥的方法来制备。但是，目前对人用罗伊乳杆菌的冷冻干燥技术研究的报道少之又少。使用适宜的冻干保护剂[6-8]是提高冻干过程菌体存活率的关键之一，也是制备高活性冻干菌剂的重要一环。

响应面分析法试验次数少、周期短，求得的回归方程精确度高，可以研究几个因素的交互作用，是降低生产成本，优化生产工艺条件的一种有效方法。近年来，响应面分析法受到越来越多的重视，并成功应用到农业、生物、食品等领域[9]。笔者采用响应曲面法对罗伊氏乳杆菌冷冻干燥保护剂进行了研究，探索最优化的保护剂组分，以提高冻干过程的菌体存活率。

1 材料与方法

1.1 菌种

罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri），由广州市微生物研究所保藏。

1.2 培养基

1.2.1 活化培养基。蛋白胨 1%、牛肉膏 1%、酵母浸粉0.5%、葡萄糖 2%、磷酸氢二钾 0.2%、柠檬酸氢二铵 0.2%、乙酸钠 0.5%、硫酸镁 0.05%、琼脂2%、pH 6.2～6.4。

1.2.2 发酵培养基。蛋白胨 1%、牛肉膏 1%、酵母浸粉1%、葡萄糖 2.5%、磷酸氢二钾 0.2%、柠檬酸氢二铵 0.2%、乙酸钠 0.5%、硫酸镁 0.05%、吐温80 0.1%、pH 6.2～6.4。

1.3 主要试剂

低聚果糖和海藻糖为生化试剂，购自上海生工生物工程技术服务有限公司；脱脂乳粉为食品级，购自新西兰恒天然集团。

1.4 罗伊氏乳杆菌的培养及冻干

取罗伊氏乳杆菌冻存管，接种于活化培养基，37 ℃下厌氧静置培养 12～24 h。挑取具有典型形态的菌落，接种于发酵培养基，37 ℃下厌氧培养 24 h ，5 000 r/min条件下离心10 min，收集菌泥；加入适量生理盐水重新悬浮。在上述菌悬液中，加入不同组别的冻干保护剂，充分搅拌溶解后，取样检测活菌数；然后，分装于西林瓶中，每瓶2 mL，每组5个重复。将各组样品置于-40 ℃冰箱中预冷4 h，然后置于预冷的冷冻干燥机中冷冻干燥16～18 h。冻干过程中观察不同冻干剂组水分升华快慢情况，待全部样品冷冻干燥充分后取出样品，取样进行活菌计数。

1.5 检测方法

采用稀释倒平板法测定乳酸菌菌落总数，具体原理和步骤参考《GB 4789-2010》[10]中乳酸菌菌落总数的测定方法，按照以下公式计算：

Rc（%）=CtC0×100

式中，Rc为冷冻干燥后罗伊氏乳杆菌的存活率，Ct为冷冻干燥后的活菌数，C0为冷冻干燥前的活菌数。

1.6 冷冻干燥保护剂的优化

根据前期的研究结果，选取低聚果糖、脱脂乳粉和海藻糖这3个因子作为研究对象，进行响应面试验，以存活率（Rc）作为试验的响应值，使用Design expert 7.5进行试验设计与数据分析。中心组合试验实际的因素与水平见表1。

2 结果与分析

2.1 响应面试验

响应面试验结果见表2 。对表2中的试验数据进行多元回归分析。方差分析表明，所选模型的F=100.255 9，P<0.000 1说明因变量Rc与全体变量之间的回归关系显著，也即模型回归显著。R2=0.989，说明因变量Rc与全体变量之间的线性关系显著。失拟项F=4.443，P=0.063 7>0.01，差异不显著，说明试验预测值和实际值相吻合，试验拟合性好，试验误差小。该研究中的变异系数为1.52%，而变异系数反映模型的置信度，其越低模型的置信度越高，说明模型方程能很好地反映真实的试验值，可用于预测酵素发酵过程中发酵液活菌数。根据模型得到的回归方程为 Rc=85.154+4.110×A+3.859×B+5.547×C-2.05×A×B-1.3×A×C-2.15×B×C-2.125×A2-4.282×B2-2.532×C2。

对回归方程的方差分析表明，因素A（低聚果糖）和B（脱脂乳粉）的交互作用（P=0.000 7<0.01）及因素B（脱脂乳粉）和C（海藻糖）的交互作用（P=0.000 5<0.01）对冷冻干燥后罗伊氏乳杆菌的存活率的影响显著。

从图1～3可以看出，响应曲面呈伞形，中心凸起，说明2因素之间的影响基本呈抛物线型关系，均有一个极大值点，呈先增大后减小的趋势。如果体系中保护剂的添加量过低，会有大量细胞裸露在介质中，在冻干时就可能改变细胞通透性，不能起到保护菌体的作用；反之，体系中保护剂太多，细胞的渗透压和通透性也会受影响，进而导致存活率下降。

以上分析表明，存在适宜的低聚果糖、脱脂乳粉和海藻糖浓度使得冷冻干燥过程中菌存活率Rc最高。最优化条件为：低聚果糖 2.66%、脱脂乳粉10.11%、海藻糖5.90%，在此条件下预测的响应值（Rc）可达89.13%。

2.2 验证试验

为验证预测值与真实值之间的拟合程度，使用上述优化条件在摇瓶水平上进行了重复验证试验：低聚 果糖 2.66%、脱脂乳粉10.11%、 海藻糖5.90%。试验按优化前和优化后的配方进行，3次重复。验证试验结果表明，优化前罗伊尔乳杆菌的存活率分别为75.8%、77.3%和73.9%（平均值为75.7%）；优化后罗伊尔乳杆菌的存活率为89.4%、88.7%和90.2%（平均89.4%），较优化前提高了13.76%，说明试验值与软件预测值的拟合性良好。

3 讨论与结论

国内对罗伊氏乳杆菌冻干保护剂的研究较少。朱战波等[11]使用二次正交旋转组合设计法对1株猪源罗伊氏乳杆菌进行了冻干保护剂的优化研究，冻干存活率达到71.6%。

笔者以乳杆菌制剂的冷冻干燥工艺中的冻干存活率为研究对象，通过响应曲面法建立了冻干保护剂低聚果糖、低脂乳粉和海藻糖与存活率Rc的关系，并实现条件优化。最优条件如下：低聚果糖 2.66%、脱脂乳粉10.11%、 海藻糖5.90%，存活率预测值为89.13%。通过验证试验证实该设计方法是切实可行的，优化后罗伊尔乳杆菌的存活率达到89.43%，且与模型预测值非常接近；罗伊尔乳杆菌的存活率较优化前提高了13.76%，优于朱战波等[11]的试验结果，为罗伊氏乳杆菌冷冻干燥工艺的开发与优化提供了研究基础。

参考文献

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安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci.2016，44（5）：15-17