中西医结合治疗对慢性乙型肝炎肝纤维化中IL-17表达与TGF-β/Smad信号转导通路的影响

李团团，谭林，李莎莎，徐元宏Δ

(1.安徽医科大学第一附属医院 检验科，安徽 合肥 230022；2.安徽省阜阳市第二人民医院 肝病科，安徽 阜阳 236015)

中西医结合治疗对慢性乙型肝炎肝纤维化中IL-17表达与TGF-β/Smad信号转导通路的影响

李团团1，谭林2，李莎莎2，徐元宏1Δ

(1.安徽医科大学第一附属医院 检验科，安徽 合肥 230022；2.安徽省阜阳市第二人民医院 肝病科，安徽 阜阳 236015)

目的 评估复方鳖甲软肝片和恩替卡韦对慢性乙型肝炎导致的肝纤维化中白细胞介素17(interleukin 17，IL-17)表达与TGF-β/Smad信号转导通路的影响。方法 150例慢性乙型肝炎患者随机分为3组，复方鳖甲软肝片组，恩替卡韦组与联合组，每组50例。48 w为1个疗程，治疗前以及治疗后第1天、24 w和48 w时取受试者血清，使用酶联免疫吸附测定IL-17、转化生长因子(transforming growth factor β1，TGF-β1)；检测肝纤维化直接指标，包括透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(CⅣ)。结果 治疗前及治疗第1天，3组间血清IL-17、TGF-β1及HF各指标HA、LN、IV-C、PCⅢ比较差异均无统计学意义。治疗24、48 w时，3组血清IL-17、TGF-β1及HF各指标HA、LN、IV-C、PCⅢ比较差异均有统计学意义(P<0.05)，且联合组<复方鳖甲软肝片组<恩替卡韦组，两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。血清IL-17、TGF-β1水平与HF指标检测水平间呈正相关关系(P<0.05)。结论 复方鳖甲软肝片和恩替卡韦联合用药治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的效果比单独用药效果显著。

慢性乙型肝炎；肝纤维化；复方鳖甲软肝片；恩替卡韦；白细胞介素-17；TGF-β/Smad

乙型病毒性肝炎导致慢性炎症持续存在，诱发肝枯否细胞分泌多种细胞因子，导致细胞外基质的大量合成和沉积，同时上皮细胞转换为具有侵袭能力的间充质细胞，造成了肝组织纤维化，最后发展为肝硬变。白介素-17(interleukin，IL-17)是Th17细胞亚群的标志性细胞因子，主要由CD4+T细胞表达，与CHB诱发的HF关系非常密切[1]。转化生长因子-β(transforming growth factor-beta，TGF-β)在多种病因诱导的组织纤维化中发挥主要作用[2]，2者在外周血的表达与肝硬化关系的研究未见报道。复方鳖甲软肝片和恩替卡韦是临床常用的治疗慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)后肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)的药物[3]。复方鳖甲软肝片能够软坚散结、化瘀解毒，可以用于CHB诱发的HF，其对早期的HF有显著疗效[4]。恩替卡韦的分子结构类似鸟嘌呤核苷，其能够磷酸化为三磷酸盐，通过与HBV内的多聚酶的底物三磷酸脱氧鸟嘌呤核苷进行竞争，抑制逆转录酶的生物活性，对乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)多聚酶具有抑制作用[5]。本研究比较了2者治疗CHB患者的临床疗效及其对CHB HF中IL-17表达与TGF-β1Smad信号转导通路的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2014年1月～2015年6月期间阜阳市第二人民医院肝病科收治的150例CHB患者。

1.1.1 入选与排除标准：入选标准：CHB患者诊断标准参照中华医学会肝病分会、中华医学会感染病学会联合制定的《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》[6]；患者年龄18～65岁。排除标准：排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒感染者；排除自身免疫性或酒精性肝病患者；排除孕妇及哺乳期妇女。

1.1.2 伦理学考量：患者签署参与知情同意书；对入选患者的信息及诊疗记录予以保密；试验方案在中国临床试验注册中心注册。

1.1.3 仪器与试剂：DNM-9606酶标分析仪(北京普朗新技术有限公司)；人IL-17 ELISA检测试剂盒(上海心语生物科技有限公司)；人TGF-β1 ELISA检测试剂盒(武汉中帜生物科技有限公司)。血清透明质酸(hyaluronic acid，HA)、层粘连蛋白(laminin，LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(CⅣ)的检测：M4000全自动化学发光测定仪及配套检测试剂盒(深圳新产业生物医学工程股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法：150例患者随机分为3组，每组50例。复方鳖甲软肝片组口服复方鳖甲软肝片(内蒙古福瑞医疗科技股份有限公司，国药准字Z19991011)，2 000 mg/次，3次/天；B组口服恩替卡韦胶囊，0.5 mg/次，1次/天；联合组复方鳖甲软肝片联合恩替卡韦。复方鳖甲软肝片组：男26例，女24例，年龄(52.34±9.43)岁；恩替卡韦组：男25例，女25例，年龄(51.26±8.84)岁；联合组：男26例，女24例，年龄(68.30±12.46)岁。3组一般情况比较差异无统计学意义。

1.2.2 检测方法：ELISA检测仪间接法测定IL-17：包被抗原；洗涤；封闭；洗涤；加被检血清；洗涤；加辣根过氧化物酶羊抗鼠IgG。ELISA检测仪间接法测定TGF-β1，操作步骤同上。HF评定：血清学评估的直接指标包括HA、LN、CⅣ、PCⅢ等，采用化学发光法测定。其中HA是最具临床实用价值的指标，它可反映HF的程度、活动性，对判断预后有重要临床意义。HF的化学发光法检测指标为HA正常值<100 ng/mL； PCⅢ(Ⅲ型前胶原)正常值<30 ng/mL；LN正常值<50 ng/mL；CⅣ正常值<30 ng/mL。

1.2.3 观察指标：1个疗程设定为48 w，检测治疗前以及治疗后第1天、第24周和48 w时患者血清中 IL-17、TGF-β1、HA、LN、CIV及PCⅢ水平。

2 结果

2.1 治疗的效果的评定

2.1.1 各组间IL-17和TGF-β1的比较：治疗前及治疗第1天，3组间血清IL-17、TGF-β1比较差异均无统计学意义。治疗24、48 w时，3组血清IL-17、TGF-β1比较差异均有统计学意义(P<0.05)，且联合组<复方鳖甲软肝片组<恩替卡韦组，两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

指标时间复方鳖甲软肝片组(n=50)恩替卡韦组(n=50)联合组(n=50)IL⁃17治疗前38 7±5 239 1±5 738 2±5 8治疗第1天36 4±4 837 4±5 335 7±4 7治疗后24周29 8±3 1∗34 9±3 525 9±2 6∗#治疗后48周25 8±2 2∗30 1±2 922 1±1 4∗#TGF-β1治疗前536 8±49 4538 3±50 6537 9±50 3治疗第1天503 5±28 3510 6±30 8494 5±27 5治疗后24周440 7±22 4∗478 5±24 6402 6±20 8∗#治疗后48周383 6±17 7∗412 4±19 8361 3±15 4∗#

*P<0.05，与恩替卡韦组比较，compared with entecavir group；#P<0.05，与复方鳖甲软肝片组比较，compared with compound Biejiaruangan tablets group

2.1.2 各组HF各指标比较：治疗前及治疗第1天，3组间血清HA、LN、IV-C、PCⅢ比较差异均无统计学意义。治疗24、48 w时，3组血清HA、LN、IV-C、PCⅢ比较差异均有统计学意义(P<0.05)，且联合组<复方鳖甲软肝片组<恩替卡韦组，两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

指标时间复方鳖甲软肝片组(n=50)恩替卡韦组(n=50)联合组(n=50)HA治疗前162 4±26 3163 2±25 8162 7±26 5治疗第1天143 4±22 4150 3±21 7139 6±21 2治疗后24周119 1±12 7∗136 2±14 5101 4±10 6∗#治疗后48周101 1±8 4∗117 7±10 685 9±7 8∗#LN治疗前168 6±18 2168 4±18 0169 1±17 9治疗第1天152 4±16 8157 3±17 2148 1±16 6治疗后24周130 5±11 8∗147 4±14 2115 4±8 7∗#治疗后48周111 3±8 4∗132 1±10 290 4±7 5∗#IV⁃C治疗前123 6±19 4122 7±20 3123 2±19 7治疗第1天106 5±17 9112 4±18 3102 3±16 7治疗后24周83 4±8 6∗95 5±10 273 2±6 8∗#治疗后48周76 2±6 8∗86 3±7 465 2±5 1∗#PCⅢ治疗前158 4±32 2160 3±30 6159 7±31 6治疗第1天145 5±29 6151 6±30 1140 3±30 4治疗后24周120 4±13 8∗139 3±15 3105 6±9 2∗#治疗后48周110 2±7 6∗128 7±10 3101 4±5 1∗#

*P<0.05，与恩替卡韦组比较，compared with entecavir group;#P<0.05，与复方鳖甲软肝片组比较，compared with compound Biejiaruangan tablet group

2.1.3 HF相关指标与IL-17、TGF-β1的关系：血清IL-17、TGF-β1水平与HF指标检测水平间呈现出高度的一致性，呈正相关关系。数据间相关性趋势见表3。

表3 IL-17、TGF-β1水平与肝纤维化指标检测水平关系

2.2 安全性评定 所有受试者均完成了全部试验，无中途退出者，亦无因血压控制不佳而改用其他疗法者。治疗48 w复方鳖甲软肝片的安全性与恩替卡韦相似，2组均无药物相关的不良反应。

3 讨论

肝纤维化是肝脏损伤与慢性炎症进展的必然结果，任何病因所致的肝脏炎症均以淋巴细胞的浸润为特征。IL-17是Th17细胞亚群的标志性细胞因子，主要由CD4+T细胞表达。此外，γδT细胞、NK细胞及中性粒细胞等也表达IL-17，在诱导炎性细胞浸润和激活等方面发挥作用。TGF-β1 是启动HF的初始因素[7]，其与细胞表面受体相互结合，能够激活其下游信号蛋白Smad2和Smad3，其与Smad4进而形成复合物，最终进入细胞核，诱导目的基因开始转录，使得肝炎患者的HF程度进一步恶化[8-9]。TGF-β/Smad信号转导通路是HF发展的关键信号通路，若阻断TGF-β/Smad信号转导则可逆转肝细胞的纤维化进程。IL-7是辅助性T细胞Th17分泌的特征性细胞因子[10]，在抵抗胞外细菌、真菌感染的宿主防御以及各种自身免疫性疾病发病中的作用非常重要[11-12]。众多研究发现[13-14]，IL-7与CHB诱发的HF关系非常密切：IL-7能作用在肝细胞外面的基质，促进HF的发生和发展，加剧CHB诱发的HF的严重程度；上调肝内的TIMP-1表达；促进III型胶原的表达；诱导单核细胞表达增强；刺激枯否氏细胞形成正反馈，造成更加严重的肝细胞损伤和HF。复方鳖甲软肝片可以活血化瘀，而HF属血瘀症，故而有充足的中医理论支持将复方鳖甲软肝片用于HF的临床治疗[15-17]。恩替卡韦则有较好的抗病毒效用，其对于CHB诱发的HF有很好的治疗效果[18-19]。故而，比较2者的单独使用以及联合使用，对于治疗CHB诱发的HF而言，符合治疗的需要而且符合医学伦理学的考量。而且，复方鳖甲软肝片对于失代偿性肝硬化也有很好的安全性和有效性，并对cccDNA有一定的抑制作用[20-21]。

本研究结果发现，在治疗期间，复方鳖甲软肝片表现出了强效的HBV抑制作用，24 w时HF指标的下降幅度大于恩替卡韦组(P<0.05)，恩替卡韦的抑制病毒作用不及复方鳖甲软肝片。另一项研究亦显示[22]，分别使用复方鳖甲软肝片和恩替卡韦治疗CHB患者，复方鳖甲软肝片组患者血清透明质酸、层粘连蛋白、IV-C (IV型胶原)和脯肽酶浓度以及肝脏纤维化程度的好转均优于恩替卡韦组，与本研究结果相符。本研究还证明了长期持续治疗，复方鳖甲软肝片比恩替卡韦更能保持较高的改善HF指标的作用，复方鳖甲软肝片组在治疗48 w时HF指标平均下降幅度比恩替卡韦组显著(P<0.05)。在整个治疗过程中，联合组在24 w和48 w 2个时间点的检测中，受试者的HF指标的下降幅度均大于复方鳖甲软肝片组和恩替卡韦组(P<0.05)。提示复方鳖甲软肝片和恩替卡韦片联合用药之后，中西医结合治疗CHB HF的效果比单独使用复方鳖甲软肝片和恩替卡韦的效果都要显著，因此临床应该更多采用复方鳖甲软肝片和恩替卡韦联合用药的治疗方案。治疗48 w复方鳖甲软肝的安全性与恩替卡韦相似，2组均无药物相关的不良反应，说明患者对两药均有很好的耐受性，但本研究仅限于48 w的观察时间，有待进一步跟踪观察复方鳖甲软肝片与恩替卡韦能否安全地用于CHB的长期治疗。本研究结果还揭示，慢性肝炎可以造成患者血清IL-17值异常升高，当使用复方鳖甲软肝片和恩替卡韦单独或者联合治疗24 w时，3组的患者血清IL-17值均有明显下降且与HF的各指标有线性相关关系(P<0.05)，其中联合组的血清IL-17值下降程度较另外2组显著(P<0.05)，而复方鳖甲软肝片组的血清IL-17值的下降幅度大于恩替卡韦组(P<0.05)，且与HF的各指标均具有线性相关关系(P<0.05)。这一研究结果与张瑞凤等[23]一致，均认为IL-7与HF关系密切，而且复方鳖甲软肝片和恩替卡韦联合治疗CHB HF的效果比单独使用的效果显著。

综上所述，TGF-β/Smad信号转导通路与HF关系密切。而且，中西医结合治疗能够干预TGF-β/Smad信号传导通路，以干扰TGF-β/Smad生成为靶点的抗HF治疗己成为当今研究的热点之一，药物调节TGF-β/Smad信号传导通路治疗HF的途径，减少TGF-β1的生成及激活。

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(编校：王俨俨)

Effect of integrative Chinese and western medicine on IL-17 and TGF-β/Smad singaling pathway in chronic hepatitis B liver fibrosis

LI Tuan-tuan1, TAN Lin2, LI Sha-sha2, XU Yuan-hong1Δ

(1.Department of Laboratory, The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230022, China; 2.Department of Liver Disease, No.2 People’s Hospital of Fuyang City, Fuyang 236015, China)

ObjectiveTo investigate the effect of integrative Chinese and western medicine on interleukin 17(IL-17) and TGF-β/Smad singaling pathway in chronic hepatitis B liver fibrosis.Methods150 cases of chronic hepatitis B were divided into three groups: compound Biejiaruangan tablets group, entecavir group and combination group, 50 cases in each group, with a consecutive treatment of 48 weeks.At pre-treatment, 1 d and 24w, 48w post-treatment, the IL-17, transforming growth factor β1 (TGF-β1)and the hepatic fibrosis indexes including HA,LN,PCⅢ,CⅣ were detected by ELISA.ResultsThere was no significant difference in serum IL-17,TGF-β1 and HF indexes of HA,LN,IV-C and PCⅢ among three groups at pre-treatment, 1 d post-treatment.There were significant differences in serum IL-17,TGF-β1 and HF indexes of HA,LN,IV-C and PCⅢ among three groups at 24,48w post-treatment, meanwhile combination group

chronic hepatitis B; liver fibrosis; compound Biejiaruangan tablets; entecavir; IL-17; TGF-β/Smad

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.07.38

中国肝炎防治基金会王宝恩肝纤维化研究基金(XJS201311)

李团团，男，硕士在读，主管检验师，研究方向：临床检验诊断学，E-mail：29512530@qq.com；徐元宏，通信作者，男，硕士生导师、教授，主任检验师，研究方向：临床检验诊断学，E-mail: xyhong1964 @163.com。

R575.1

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