胃铋镁对胃癌细胞凋亡的诱导作用及机制研究

乔巍，邸军，汪小莞，孙佳昕，张琦，李江，李晓萌Δ

(1.东北师范大学 生命科学学院 分子表观遗传学教育部重点实验室，吉林 长春 130024； 2.吉林省人民医院 病理科，吉林 长春 130000；3.吉林大学口腔医院 口腔修复科，吉林 长春 130041)

胃铋镁对胃癌细胞凋亡的诱导作用及机制研究

乔巍1†，邸军2†，汪小莞1，孙佳昕1，张琦1，李江3Δ，李晓萌1Δ

(1.东北师范大学 生命科学学院 分子表观遗传学教育部重点实验室，吉林 长春 130024； 2.吉林省人民医院 病理科，吉林 长春 130000；3.吉林大学口腔医院 口腔修复科，吉林 长春 130041)

目的 研究胃铋镁对胃癌细胞株SGC-7901增殖和凋亡的作用及可能机制。方法 以三联药(三种市售胃炎胃溃疡类药物联合用药)、胃铋镁、胃铋镁中药总组分、胃铋镁化药总组分为实验组，分别作用于胃癌细胞SGC-7901，MTT法检测细胞的增殖状态；Hoechst33342染色法检测细胞的凋亡；流式细胞仪检测细胞周期；Western blot法检测STAT3信号通路相关蛋白的表达。结果 4种药物分别处理细胞后，相比于对照组和三联药组，胃铋镁组和胃铋镁中药总组分组能够显著抑制细胞增殖且具有剂量依赖性；凋亡百分数显著增高(P<0.05)；能将细胞周期阻滞于G1期(P<0.05)；Western blot结果显示SGC-7901细胞中STAT3、磷酸化STAT3(p-STAT3)、CyclinD1、Bcl-2蛋白表达量显著降低。结论 胃铋镁及其中药总组分可以显著抑制胃癌细胞SGC-7901增殖，促进细胞凋亡，阻滞细胞周期，其作用机制可能与抑制STAT3信号通路相关蛋白p-STAT3、CyclinD1、Bcl-2表达有关。

胃铋镁；胃癌；STAT3信号通路

胃癌(gastric cancer)是胃上皮来源的恶性肿瘤，据统计，2015年我国胃癌的新发病例为67.91万，死亡病例为49.8万，占我国消化道恶性肿瘤的首位，成为我国第二大致死癌症[1]。近年研究表明，萎缩性胃炎及其伴有的肠化生、细胞异型增生与胃癌的发生关联紧密；提示对萎缩性胃炎具有显著疗效的药物，特别是多靶点的组方药物可能具有预防和治疗胃癌的潜在功能[2]。胃铋镁颗粒是我国具有自主知识产权的国药准字号药物，对临床上各种胃炎、胃溃疡和胃黏膜损伤有很好的疗效。胃铋镁为复方制剂，由中药总组分(甘草浸膏粉、弗朗鼠李皮、茴香粉、石菖蒲和芦荟)和化药总组分(铝酸铋、重质碳酸镁和碳酸氢钠)组成。该药物不仅具有胃黏膜保护作用，其中多种中药活性组分还具有细胞信号的调节功能和机体免疫的调节功能，具有很好的抗肿瘤功能的开发前景[3]。本研究旨在从细胞学角度探讨胃铋镁对胃癌SGC-7901细胞株增殖能力的影响，研究胃铋镁调节SGC-7901细胞内STAT3信号的作用机制，为胃铋镁药物在胃癌防治方面的应用和可能组分开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株：胃癌SGC-7901 细胞系由本实验室保存。

1.1.2 药品与试剂：DMEM培养基和胎牛血清(FBS)购自美国GIBCO公司。MTT Hoechst33342染色液购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；胃铋镁药物及其各组分药物由弘美制药中国有限公司提供；三联药：克拉霉素片购自上海雅培制药有限公司；阿莫西林胶囊购自联邦制药股份有限公司；埃索美拉唑镁肠溶片购自阿斯利康制药有限公司。

1.1.3 仪器：酶标仪(ELx808，美国Bio-Tek公司)；流式细胞仪(EPICS-ELITE-ESP)；荧光显微镜(Olympus，Japan)；电泳仪(JM-250，大连捷迈科贸有限公司)；电转槽(Biorad)。

1.2 方法

1.2.1 药物浓度设定：药物浓度根据说明书定量，将如下浓度作为药物处理的标准浓度，分别是三联药：克拉霉素片1.8 μg/mL、阿莫西林胶囊5.6 μg/mL、埃索美拉唑镁肠溶片0.1 μg/mL；胃铋镁100 μg/mL；胃铋镁中药总组分71.4 μg/mL；胃铋镁化药总组分28.6 μg/mL。同时设置此浓度条件下的1/3浓度作为低浓度，3倍浓度作为高浓度，每种药物采用3个浓度作为实验浓度作用于胃癌SGC-7901 细胞。

1.2.2 细胞培养和分组：利用含10%的标准胎牛血清培养SGC-7901细胞，置于5%的CO2、37 ℃恒温孵箱中，平均3～4 d传代一次。取对数生长期的SGC-7901细胞进行实验。按照1.2.1下浓度设定分为对照组、三联药组、胃铋镁组、胃铋镁中药总组分组和胃铋镁化药总组分组。

1.2.3 MTT法检测细胞增殖：利用0.25%胰蛋白酶消化胃癌SGC7901细胞，用含10%胎牛血清的DMEM制成细胞悬液，以每孔2×103cells接种于96孔板中，每孔培养液100 μL，第2天细胞更换成1%FBS的DMEM培养，按1.2.2下分组加入各种药物，培养24 h后，每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，37 ℃，继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解。选择450 nm波长和620 nm波长，用A450 nm-A620 nm表示吸光度，在酶标仪上测定各孔光吸收值。以时间为横轴，吸收值为纵轴绘制细胞增殖曲线。实验重复3次。

1.2.4 Hoechst33342染色观察凋亡细胞核：利用0.25%胰蛋白酶消化胃癌SGC7901细胞，用含10%胎牛血清的DMEM制成细胞悬液，以每孔1×105cells接种于6孔板中，每孔培养液2 ml，第2天细胞更换成1% FBS的DMEM培养，按1.2.2下分组加入各种药物，作用24 h后，直接加入配置好的Hoechst33342染色液，37 ℃染色30 min。 PBS洗2次后，加入新的PBS液，荧光显微镜下观察拍照。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞周期：利用0.25%胰蛋白酶消化胃癌SGC7901细胞，用含10%胎牛血清的DMEM制成细胞悬液，以每孔1×106cells接种于6孔板中，每孔培养液2 mL，第2天细胞更换成1% FBS的DMEM培养，按1.2.2下分组加入各种药物，作用24 h，胰酶消化离心收集并悬于PBS中，70%乙醇固定30 min，用含RNase及碘化丙锭的染色液染色30 min，流式细胞仪测定DNA含量变化，用MULTICYCLE软件处理结果。流式细胞术测定细胞周期。

1.2.6 Western blot法检测STAT-3信号通路相关蛋白的表达：按1.2.2下分组处理细胞，RIPA消化提取蛋白，并配置成相同浓度的蛋白质溶液。配置12%分离胶和5%浓缩胶，调整电压80～120 V电泳2 h，300 mA恒定电流转膜4 h，室温牛奶封闭1 h，加一抗(STAT3、p-STAT3、CyclinD1、Bcl-2稀释倍数均为1:200)4 ℃过夜，TBST洗涤3次，每次5 min。加入二抗室温反应1 h，TBST洗涤3次，每次10 min。进行化学发光反应、曝光并进行灰度值分析。

2 结果

2.1 胃铋镁对胃癌SGC-7901细胞株增殖的影响 MTT结果显示：与对照组和三联药组相比，胃铋镁组和胃铋镁中药总组分组能显著抑制细胞增殖，差异均有统计学意义(P<0.05)；且随着药物浓度的增加，胃铋镁和胃铋镁中药总组分组对细胞的增殖抑制率逐渐上升并且呈现量效关系。表明胃铋镁和胃铋镁中药总组分能够显著抑制SGC-7901细胞增殖且具有剂量依赖性。见表1。

表1 胃铋镁对SGC-7901细胞增殖的影响

*P<0.05，**P<0.01，与对照组比较，compared with control group

2.2 胃铋镁对胃癌SGC-7901细胞株凋亡的影响 荧光显微镜下显示：对照组、三联药组及胃铋镁化药总组分组细胞核均呈卵圆形，染色质均匀着色并分布于整个细胞核，荧光强度较强。胃铋镁组和胃铋镁中药总组分组的细胞染色质凝聚、断裂、呈点状，着色不均匀呈亮点状，见图1。对凋亡细胞进行统计，结果显示胃铋镁组和胃铋镁中药总组分组较对照组能显著抑制细胞凋亡(P<0.05)；而三联药组的凋亡诱导效应不显著，见表2。

图1 胃铋镁对胃癌SGC-7901细胞株凋亡的影响Fig.1 Apoptosis effect of Weibimei on SGC-7901 cell

组别细胞凋亡率(%)对照组5 594±3 816三联药组7 605±2 586胃铋镁组30 764±7 770∗∗胃铋镁中药总组分组17 070±4 824∗胃铋镁化药总组分组10 232±1 869

*P<0.05，**P<0.01，与对照组比较，compared with control group

2.3 胃铋镁对胃癌SGC-7901细胞周期的影响 流式结果显示：与对照组比较，胃铋镁组和胃铋镁中药总组分组G1期细胞数量显著增多，S期细胞明显减少(P<0.05)，说明胃铋镁及其中药总组分能阻滞SGC-7901细胞周期在G1期，见表3。

表3 胃铋镁对SGC-7901细胞周期的影响

*P<0.05，**P<0.01，与对照组比较，compared with control group

2.4 胃铋镁对胃癌细胞SGC-7901细胞中STAT3信号通路相关蛋白表达的影响 Western blot结果显示：与对照组相比，胃铋镁组及胃铋镁中药总组分组SGC-7901细胞中的STAT3、p-STAT3蛋白表达量均减少，且STAT-3信号靶基因CyclinD1、Bcl-2的蛋白表达也明显降低。其中，胃铋镁中药单组分中的弗朗鼠李皮、茴香和石菖蒲处理后STAT-3信号通路蛋白的下降最为显著。这些结果说明胃铋镁可通过抑制STAT3信号通路来影响胃癌细胞的增殖活性，且主要是通过其中药组分中的弗朗鼠李皮、茴香和石菖蒲。见图2。

图2 胃铋镁对胃癌细胞SGC-7901细胞中STAT3信号通路相关蛋白表达的影响Fig.2 The protein expression related to STAT3 signaling pathway in SGC-7901cell treatment by Weibimei

3 讨论

胃癌严重威胁人类的健康，是全世界最常见的消化道肿瘤之一[4]。SGC-7901细胞株是人胃腺癌细胞株，具有相对较高的转移特性，是具有代表性的胃癌细胞株。本研究以该细胞株为模型，应用MTT，Hoechst 33342染色方法来检测胃铋镁和胃铋镁各组分对胃癌SGC-7901细胞株增殖/凋亡能力的影响。结果表明，胃铋镁可以显著抑制胃癌细胞SGC-7901增殖，促进细胞凋亡，并且这种作用效果主要来自胃铋镁中药总组分。

胃癌发生发展过程中存在着细胞周期调控机制的紊乱，细胞周期失控是肿瘤恶性增殖的根本原因[5]。本研究通过细胞周期实验检测了胃铋镁对胃癌细胞SGC-7901周期的影响。结果表明，胃铋镁作用SGC-7901细胞后，细胞G1期细胞增加，S期细胞减少，细胞发生了G1期阻滞；提示胃铋镁通过影响细胞G1/S期转换作用实现了对胃癌细胞增殖的抑制效应。

STAT3作为一种转录因子，促进细胞增殖信号的开启，在胃癌发生发展过程中发挥重要作用[6]。大量研究数据表明，STAT3持续激活是肿瘤细胞异常增殖和恶性转化的关键变化。异常活化的STAT3信号增强了肿瘤的抗凋亡抗耐药能力，促进了肿瘤的侵袭、转移及血管新生[7-9]。STAT3信号的异常活化与胃癌的发生发展、转移、预后都有密切关系[10]。本实验研究结果表明，与对照组相比，胃铋镁能下调STAT3和p- STAT3的表达，说明胃铋镁可以抑制STAT3激活，并抑制STAT3信号调节下的cyclinD1和Bcl-2等增殖基因。

研究发现早期胃癌、进展期胃癌组织中的cyclinD1表达率显著高于正常胃黏膜组织[11]。cyclinD1是常见的细胞周期蛋白，是STAT3下游重要的靶基因，主要功能是促进细胞增殖和分裂，干扰cyclinD1的表达可以使胃癌细胞阻滞在G1期[12]。本实验研究也发现，胃铋镁作用胃癌细胞SGC-7901后，细胞周期阻滞在G1期，与对照组相比，cyclinD1的表达减弱。在细胞凋亡程序中，有一个关键基因Bcl-2，它具有抑制细胞凋亡的功能，在胃癌细胞中，它通过延长细胞生存期、增加肿瘤侵袭能力来有效抑制细胞凋亡[13]。本实验发现，与对照组相比，胃铋镁能够显著下调Bcl-2的表达，促进细胞凋亡。

综上所述，胃铋镁能显著抑制胃癌SGC-7901细胞增殖，促进细胞凋亡，阻滞细胞周期，这种作用效果主要来自胃铋镁中药总组分。胃铋镁抗肿瘤的作用机制可能与中药组分能降低STAT3信号通路相关蛋白p-STAT3、CyclinD1、Bcl-2的表达有关。下一步将研究胃铋镁中药各组分的作用机制。

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(编校：吴茜)

Study on functions and mechanisms of Weibimei in inducing gastric cancer cell apoptosis

QIAO Wei1†, DI Jun2†，WANG Xiao-wan1, SUN Jia-xin1, ZHANG Qi1, LI Jiang3Δ, LI Xiao-meng1Δ

(1.Key Laboratory of Molecular Epigenetics of MOE, School of Life Sciences, Northeast Normal University, Changchun 130024, China; 2.Department of Pathology,People’s Hospital of Jilin Province,Changchun 130000,China;3.Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Stomatologic Hospital, Jilin University, Changchun 130041)

ObjectiveTo investigate the proliferative and apoptotic effects of Weibimei on gastric cancer cell and the possible mechanisms.MethodsGastric cancer SGC-7901 cell were cultured with four drugs：Sanlianyao(three kinds of drugs for the treatment of gastric ulcer), Weibimei, Chinese medicine of Weibimei, and Chemical drugs of Weibimei as the experimental groups.The proliferation of SGC-7901 cell was determined by MTT assays.The cell apoptosis was evaluated by Hoechst33342 staining.The effect on SGC-7901 cell cycle was measured by flow cytometry.The protein expression related to STAT3 signaling pathway in SGC-7901cell was examined by Western blot.ResultsAfter SGC-7901cells were treated line with each four drug for 24h, Weibimei or its Chinese medicine portion could obviously inhibit the proliferation of SGC-7901 cells in a dose-dependent manner and increase the percentage of apoptosis rate significantly (P<0.05).In addition, the cell cycle of SGC-7901 arrested at G1 phase with the general or Chinese medicine portion of Weibimei supplement.Furthermore, Weibimei and its Chinese medicine portion down-regulated the expression of STAT3, phosphorylated STAT3(p-STAT3), CyclinD1, and Bcl-2 in SGC-7901 cells.ConclusionWeibimei, and its Chinese medicine portion exerted potent anticancer activity by inhibiting cell proliferation, inducing apoptosis and arresting the cell cycle in gastric cancer SCG-7901 cells, and this function was associated with STAT3 signaling inhibition.

Weibimei; gastric cancer; STAT3 signaling pathway

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.07.05

科技部国际合作项目资助课题(2010DFA31430)；国家自然科学基金(30871301，30700827)；吉林省科技厅科研基金资助课题(20130521010JH， 20150101187JC，20150414007GH)；吉林省教育部科研基金资助课题(2015-526， 2015-551)；高校基本科研业务费专项基金(2412015ZH005，130017507)；高校人才引进项目资助课题(B07017)；吉林省产业创新专项(2016C047-3)

乔巍，女，硕士在读，研究方向：肿瘤信号转导，E-mail：qiaow634@nenu.edu.cn；邸军，共同第一作者，男，主任医师，研究方向：肿瘤信号转导，E-mail:Dijun1991@163.com；李晓萌，通信作者，女，教授，博士生导师，研究方向：肿瘤信号转导，E-mail：lixm441@nenu.edu.cn； 李江，共同通信作者，男，教授，硕士生导师，研究方向：肿瘤信号转导，E-mail：ljiang@jlu.edu.cn。

R735.2

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