基于Walker 256恶性胸水模型的中药甘遂量毒效关系研究

2016-07-09沈娟唐于平徐远超开钧宿树兰钱大玮张丽段金廒

中国中药杂志 2016年9期

沈娟唐于平徐远超开钧宿树兰钱大玮张丽段金廒

[摘要]該文考察中药甘遂的量毒效关系，探讨甘遂的毒效变化特点，为临床安全合理用药提供科学依据。以恶性胸水模型为研究对象，在较大剂量范围内（甘遂0045～1620 g·kg-1·d-1）考察甘遂对实验动物生化指标、胸水量等的影响，并通过因子分析方法综合评价甘遂的量毒效关系。结果显示，模型组大鼠具有较多的胸水量，且与空白组比较，ALT，AST，LDH，HBDH，IFNγ，IL2，TNFα显著升高（P<005），TP，ALB降低（P<005）。给药后，与模型组比较，各组可不同程度的减少胸水量，降低IFNγ，IL2，TNFα，升高TP，ALB，体现出一定的治疗作用，同时引起ALT，AST，LDH，HBDH升高，体现出一定的肝、心脏毒性。通过因子分析从9个指标中抽提出2个公因子，共解释了891%的信息。结果表明，甘遂在《中国药典》剂量范围内单独给药没有见到明显毒性，在药典高限3倍剂量下可产生肝脏、心脏毒性，随着剂量增加，毒性增强；同时甘遂具有“峻下逐水”功效，可减少恶性胸水模型大鼠的胸水量及改善相关生理指标，且具有剂量依赖性。综合分析其毒效特点，甘遂药典高限剂量为其相对最佳治疗剂量。

[关键词]甘遂；量毒效关系；因子分析；恶性胸水

[Abstract]To investigate the dosagetoxicityefficacy relationship of Kansui Radix， explore its regularity of the toxicity and efficacy change， and provide scientific basis for its clinical rational application， the malignant pleural effusion models were used to observe the effect of Kansui Radix with larger dose range （00451620 g·kg·d-1 for Kansui Radix） on biochemical indexes and hydrothorax volume in experimental animals Factor analysis method was also used to comprehensively assess the dosagetoxicityefficacy relationship of Kansui Radix The results showed that the rats in model group had larger hydrothorax volume， and ALT， AST， LDH， HBDH， IFNγ， IL2 and TNFα levels were significantly increased （P<005）， while TP and ALB levels were decreased （P<005） as compared with the blank group After drug administration， various treatment groups decreased hydrothorax volume， IFNγ， IL2， TNFα and increased TP and ALB levels as compared with model group， indicating certain therapeutic effect； and increased ALT， AST， LDH and HBDH levels， indicating certain liver and cardiac toxicity In the factor analysis， two common factors were extracted from nine indexes， explaining 891% of the information The analysis results suggested that there was no obvious toxicity in case of independent use of Kansui Radix within the dosage range set in pharmacopeia， while it would produce liver toxicity and cardiac toxicity upon 3 times of the dosage set in pharmacopeia， and the toxicity was increased with the increase of dose At the same time， Kansui Radix can decrease the hydrothorax volume in malignant pleural effusion models and improve relevant physical indexes in a dosedependent manner Comprehensive analysis results of its toxic effect characteristics indicated that the upperlimit dose of Kansui Radix in pharmacopeia shall be regarded as the relatively optimal therapeutic dose

[Key words]Kansui Radix； dosagetoxicityefficacy relationship； factor analysis； malignant pleural effusion

doi：10.4268/cjcmm20160923

中医药是中华民族的瑰宝，经过几千年的临床实践检验，为中华民族的繁荣昌盛做出了巨大贡献[12]。疗效是中医药得以存续以及发展的根本，提高其疗效则是目前振兴中医药事业的首要之策。中医自古认为“中医不传之秘在于量”，这说明剂量是保证中药临床安全有效的重要因素，也说明了中药量毒效关系的复杂性[34]。

甘遂为大戟科植物甘遂Euphorbia kansui TN Liou ex TP Wang的干燥块根，是我国传统中药，历代本草皆有收载，具有泄水逐饮、消肿散结的功效[5]。甘遂功效显著、作用迅猛，被称为“泄水圣药”；同时又具有毒效并存的特点，在《神农本草经》中列为下品。李慧玉等[6]研究发现甘遂对水负荷小鼠具有较好的利尿作用，但对肾脏产生一定的毒性。甘遂经醋炙后，可降低其肾脏毒性，同时利尿作用增强[7]。姜玮等[8]研究表明，甘遂对斑马鱼具有明显毒性作用，并具有一定的量毒关系。笔者在前期研究中[9]亦发现甘遂对小鼠具有一定的肝、肾毒性。甘遂虽药效显著，但因其存在毒性，故在临床上的应用受到很大限制。基于此，科学阐释甘遂的量毒效关系，对于其临床的安全合理应用显得尤为重要。

中医药传统理论对药物的药效和毒性具有独到的认识，“是药三分毒”，对于药物的药效与毒性应辩证对待。《黄帝内经》中“有故无殒”之说，及现代认为的“有病则病当之，无病则体受之”思想，皆是强调了中药的毒性与疗效并存，并且随着机体疾病状态的不同而发生改变[1011]。因此，本文建立Walker 256恶性胸水模型，在较大剂量范围（甘遂0065～2340 g·kg-1·d-1）考察甘遂“峻下逐水”效应及对实验动物生化指标等的影响，并通过因子分析方法综合分析甘遂的量毒效关系，为甘遂的安全合理应用提供参考。

1材料

11药物甘遂产自陕西宝鸡红河谷地区（批号111206），由南京中医药大学王春根教授鉴定，为大戟科植物甘遂E kansui的干燥块根。甘遂打粉过100目筛，用前加超纯水配成所需药液浓度。呋塞米购自上海朝晖药业有限公司，批号1206F04。

12动物Wistar大鼠，72只，雄性，SPF级，体重220～250 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK（京）20120001。自由进食及饮水，实验室温度（22±2）℃，湿度60%～80%，人工光照约12 h明暗周期，并定期消毒。

13瘤株与试剂Walker 256细胞株购自上海斯信生物科技有限公司；丙氨酸氨基转移酶（ALT），天冬氨酸氨基转移酶（AST），总蛋白（TP），白蛋白（ALB），肌酐（CREA），碱性磷酸酶（ALP），尿氮素（BUN），总胆红素（TBIL），血糖（GLU），甘油三酯（TG），肌酸磷酸激酶（CK），总胆固醇（TCHO）测定试剂盒，AU生化专用清洗液，生化多项校准品，生化多项质控品1，生化多项质控品2均购自美国贝克曼公司；大鼠γ干扰素（IFNγ）酶联免疫分析试剂盒，大鼠白细胞介素2（IL2）酶联免疫分析试剂盒，大鼠肿瘤坏死因子α（TNFα）酶联免疫分析试剂盒均购自南京建成生物工程有限公司。

14仪器AU680全自动生化分析仪（美国贝克曼公司）；EPED超纯水系统（南京易普达易科技发展有限公司）；酶标仪（美国Molecular Devices公司）。

2方法

21造模方法Walker 256細胞株每周传代1次，7 d后抽取小量腹水，置于消毒的干试管内，镜下进行细胞分类计数。以生理盐水调整细胞浓度，用细胞计数板计数肿瘤细胞浓度至5×107个/mL。用台酚蓝拒染法检测细胞存活性，提示活细胞数>95%时，再抽取腹水放入无菌容器内，置冰块上保存，以上法稀释调整细胞浓度至1×107个/mL。大鼠麻醉后，将大鼠右侧背部用刮刀脱毛，局部常规消毒，用穿刺针自大鼠右侧腋后线与11，12肋间交点处垂直刺入，当针头刺入胸膜腔时感觉有落空感后向胸腔内注入03 mL上述肿瘤细胞悬液。正常对照组注射等量生理盐水。

22分组与给药大鼠随机分为空白对照组、模型组、阳性药组（呋塞米4 mg·kg-1）、不同剂量甘遂给药组，共9组，每组8只。根据甘遂药典用量（甘遂05 ～ 15 g，换算成大鼠等效量为甘遂0045～0135 g·kg-1），共设置6个给药剂量，分别为0045 g·kg-1（药典低限剂量，以下简称低限剂量）、0135 g·kg-1（药典高限剂量，以下简称高限剂量）、0405 g·kg-1（药典高限3倍剂量，以下简称3倍剂量）、081 g·kg-1（药典高限6倍剂量，以下简称6倍剂量）、1215 g·kg-1（药典高限9倍剂量，以下简称9倍剂量）和1620 g·kg-1（药典高限12倍剂量，以下简称12倍剂量）组。以上各组自造模后第2天灌胃给药1次/d，给药剂量按体重计001 mL·g-1，给药7 d。

23生化指标测定在给药第7天末，每组大鼠眼眶静脉丛取血，离心后取血清，按说明书要求测定ALT，AST，TP，ALB，CREA，ALP，BUN，TBIL，GLU，TG，CK，TCHO，IFNγ，IL2，TNFα水平。

24胸水量测定在给药第7天末，每组大鼠颈动脉放血处死动物，称重，小心剖开胸腔，用注射器抽取胸水并用吸水纸吸干胸水后再次称重，2次称重差即为胸水量。

25统计学方法所有实验数据以±s表示，各组之间比较采用单因素方差分析以及因子分析，均采用SPSS 170统计软件处理，显著性概率水平α=005。

3结果

31一般情况观察正常组大鼠精神状态良好，行动灵活，毛发光泽，二便正常。模型组及给药组大鼠精神萎靡，被毛脏乱、红染，嘴唇青紫，肛周污秽。各组大鼠每2 d称重1次，结果见表1。模型组及给药组大鼠体重在造模后前3 d体重有增长趋势，且比空白组增长快，可能因胸水生成，导致体重增加。造模后期，体重开始减少，主要由于后期大鼠进食减少而造成。与空白组比较，给药7 d，模型组、阳性组及低限剂量组体重显著降低（P<005），随着甘遂给药剂量的增加，体重有恢复趋势，与空白组逐渐接近，并具有一定的剂量依赖性。

沈娟等：基于Walker 256恶性胸水模型的中药甘遂量毒效关系研究表1不同剂量甘遂对体重的影响（±s，n=8）

。

32对大鼠胸水量的影响不同实验组大鼠的胸水量见表2。与模型组比较，各给药组均可不同程度的减少胸水量（P<005），且具有一定的剂量依赖性。其中，药典高限剂量可明显降低大鼠胸水量，随着剂量增加，胸水量减少。各组胸水量由多到少依次为：模型组>低限剂量组>阳性组>高限剂量组>3倍剂量组>6倍剂量组>9倍剂量组>12倍剂量组。

33对大鼠血清生化指标的影响不同实验组大鼠的生化指标结果见表2。与空白组比较，模型组ALT，AST，LDH，HBDH，IFNγ，IL2，TNFα显著升高（P<005），TP，ALB降低（P<005）。给药后，与模型组比较，各组可不同程度的引起ALT，AST，LDH，HBDH升高，体现出一定的肝、心脏毒性，引起IFNγ，IL2，TNFα降低，TP，ALB升高，体现出一定的治疗作用。其中，甘遂剂量大于或等于药典高限剂量时，与模型组比较，可显著升高IFNγ，TNFα值（P<005）；甘遂剂量大于或等于药典高限表2不同剂量甘遂对胸水量及生化指标影响

34基于因子分析的甘遂量毒效关系研究采用因子分析法提取给药后变化明显的9个指标的公因子，见表3。首先进行预计算及适用性检验，KMO统计量=0745>07，可以接受，Bartlett′s Test χ2=135896，单侧P=0000<001，表明适宜做因子分析。根据因子分析原则，以特征值大于1为显著性标准，有2个公因子特征值>1，提取这2个公因子，对总方差的累积贡献率为891%，即构成的模型可解释原始数据的891%的信息，故采用这2个公因子代替原始变量对甘遂量毒效关系进行分析。根据预计算结果，在因子分析中，自定义提取2个公因子，采用方差最大正交旋转，得到各因子得分系数及载荷系数，见表3。变量载荷绝对值越大对公因子的影响越大，从表3可以看出，公因子1（F1）主要由TP，ALB，IFNγ，IL2，TNFα主导，这些指标主要反映甘遂“峻下逐水”功效及对恶性胸水的治疗效应；公因子2（F2）主要由ALT，AST，LDH，HBDH主导，这些指标主要反映肝脏、心脏毒性。因此F1可以解释为效应公因子；F2可以解释为毒性公因子。其中，F1的贡献率为47750%，F2的贡献率为41352%，两者贡献率接近，即甘遂在治疗恶性胸水时既具有一定的治疗作用也存在毒性，临床用药需谨慎权衡毒效作用。根据因子载荷图可以很直观地看出甘遂的量毒效关系的演变趋势，见图1，图中标记点为各组数据的均值。模型组在横轴方向和纵轴方向都远离正常组。给予不同剂量甘遂后，随着给药剂量增加，在纵轴方向与模型组偏离越来越远，并向着空白组靠近，表明甘遂具有一定的治疗作用；同时，在横轴方向，随着给药剂量增加，各组向着远离空白组和模型组方向偏离越远，表明毒性也增加；两者均具有一定的剂量依赖性。综合考虑甘遂的毒性和治疗效应，选择药典高限剂量给药最佳，此时不仅具有较好的治疗作用，且没有表现出明显的毒性作用。

4讨论

甘遂作为我国传统的有毒中药，具有峻下逐水作用，逐水能力很强，被后世医家誉为“泄水之圣药”；又具有毒效并存，难以控制的特点。《本草衍义》谓其：“此药专于行水功决为用，入药需斟酌”[12]。甘遂因其在用药剂量上难以把握，限制了其在临床上的广泛应用。因此，充分理解并阐释甘遂的毒效变化特点对于指导临床合理用药意义重大。本文建立了Walker 256恶性胸水模型，在较大剂量范围考察了甘遂剂量与毒性和效应的关系，从给药后对大鼠血清生化指标、大鼠胸水量等的影响并结合因子分析方法研究了不同剂量甘遂的毒效变化特点。由实验结果可以看出，甘遂在药典规定的剂量范围内单用没有明显毒性；超过药典规定剂量，甘遂单用对肝、心脏有不同程度的损害，可引起相关生化指标异常；同时，甘遂对恶性胸水具有一定的治疗作用，可明显减少胸水量，改善相关血清生化指标，同时引起TP，ALB值升高，表明其“峻下逐水”作用引起血液浓缩。由因子分析中，各组与空白组、模型组偏离程度，可发现随着甘遂剂量的增加，其“峻下逐水”效应增强，同时肝脏、心脏毒性也增加。综合考虑毒性与效应，甘遂药典高限剂量为最佳治疗剂量，既具有较好的治疗作用，又没有明显的毒性。

随着社会的发展，科技的进步，中药正在逐步走向国际化。然而，近年来中医药屡遭质疑与诟病，关键是中医药的疗效与安全性问题。而把握恰当的用药剂量，不仅能保证临床用药安全有效，而且也体现出了中医治病的精髓。现行《中国药典》中记载的中药用量主要是基于传统用药经验，缺乏现代科学的阐释与支撑。因此，明确中药用药剂量，研究其量毒效关系，对于保证中药尤其是有毒中药临床用药的安全有效具有重要意义。

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