藏药“蒂达”基原植物中主要有效成分的HPLC定量分析

杨晓泉 郭永强 夏从龙

[摘要]“蒂达”是藏药中治疗肝胆疾病最具有代表性的常用药物之一，比较藏药“蒂达”基原植物中7种有效成分的含量，并进行整合评控，为其资源利用提供了科学依据。该文采用HPLCDAD扫描3D图谱，直接获得各环烯醚萜类、口山酮及齐墩果酸的最适宜吸收波长。根据结果开启210， 240， 265 nm多波长采集数据同时检测7种有效成分。通过分析计算，7种成分在线性范围内线性关系良好，相关系数r均达到0999 9，平均回收率99%～101%，RSD均小于3%。对结果进行归一化与三维数据集成化，获得各种植物化学品质综合指数。上述结果表明藏药“蒂达”基原植物中绝大多数含有这7种有效成分，但种间差异较大，通过化学品质综合指数进行整合评控对质量控制有参考价值。

[关键词]“蒂达”；HPLCDAD；多波长检测；化学品质综合指数；整合评控

[Abstract]"Dida" is one of the most representative commonly used Tibetan medicines in treatment of hepatobilaiary diseases To analyze and compare the content of 7 effective constituents in 11 species which are used as Dida Integrated evaluation of them， which supply a basis for the resources exploitation for them In this paper， most appropriate absorption wavelengths of different natural iridoid compounds， xanthones and oleanolic acid have been performed by using 3D spectrum technique According to the results， the wavelength 210， 240 and 265 nm were used for detection of 7 effective constituents By means of calculation， determination of 7 effective constituents indicated good linearity over the linear range with coefficients （r） of 0999 9 respectively The recoveries were found in the average range of 99% to 101% with RSD being less than 3% Normalize and integrate by threedimension the data Get their integrated chemical quality index（ICQI） Results suggested that these plants used as Dida in Tibet medicine mostly contain these 7 effective constituents， but the different is notable The integrated evaluation by the integrated chemical quality index （ICQI） has reference value for quality control

[Key words]Dida； HPLCDAD； multiple wavelength detection； integrated chemical quality index（ICQI）； integrated evaluation

doi：10.4268/cjcmm20160919

“蒂达”是藏药中治疗肝胆疾病最具有代表性的常用药物之一，具有悠久的用药历史，它指“味苦，能治疗肝胆疾病”的一类功效相近的药物的“总称”，《晶珠本草》[1]记载：“蒂达可清热，治胆病、血病，有清肝利胆、退诸热的作用。”其基原植物统称为“藏茵陈”，在云南、四川、西藏等地分布极广。沈黎明等[2]整理蒂达在云南分布，认定青叶胆Swertia mileensis，紫红獐牙菜S punicea，丽江獐牙菜S delavayi，椭圆叶花锚H elliptica等作为藏茵陈使用；姜海等[3]调查蒂达在四川分布，认定川西獐牙菜S mussotii，圈纹獐牙菜S cincta，大籽獐牙菜S macrosperma为藏药蒂达基原植物；钟国跃等[4]整理藏药蒂达品种，认定其基原植物涉及龙胆科獐牙菜属Swertia，花锚属Halenia，扁蕾属Gentianopsis及虎耳草科虎耳草属Saxifraga等，其中青叶胆S mileensis自1975年以后均被收载于《中国药典》。“蒂达”原植物中普遍含有环烯醚萜类（獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷等）、口山酮类成分和齐墩果酸等活性成分，系“蒂达”的重要药效物质基础。现代药理学研究表明，环烯醚萜类具有保肝利胆、抑制中枢神经、镇痛、抗炎、抗原虫和抗结核等作用[56]；口山酮单体成分具有促进胆固醇排泄、利胆、保肝、免疫调节、抗氧化等作用[7]；齐墩果酸具有护肝、解肝毒、降糖、降脂、抗炎及增强机体免疫功能等作用[6，8]。

植物药含有丰富的化学成分，單一指标、单纯评价方式都具有一定的片面性。综合评价从整体上评价药材的化学品质，避免了仅以含量高低论质量，逐渐成为了品质评价的重要发展方向[9]。引入去量纲操作、多元统计分析等研究方法，实现复杂结果简单化，用综合的指标，更强的品质评控力，反映药物的化学综合品质[10]。本文提出化学品质综合指数（integrated chemical quality index， ICQI）的评价方法，通过归一化和三维集成化数据处理方法，将化学品质综合指数刻画为一个0～1的相对数值，实现化学品质综合量化集成。根据文献查阅，有关“蒂达”基原植物的环烯醚萜类、口山酮类成分和齐墩果酸多波长多通道同时测定，以及建立合理计算化学品质综合指数方法未见报道。本实验建立了“蒂达”基原植物中7种化学成分的高效液相色谱定量分析方法，并通过归一化集成化计算了化学品质综合指数。

1材料

仪器Agilent 1100高效液相色谱仪（G1311A QuatPump，G1313A ALS，G1316A COLCOM，G1315B DAD检测器，美国安捷伦公司）；AE240 1/10万电子天秤（梅特勒托利多仪器（上海）有限公司）；SK5200H型超声波清洗机（上海科导超声仪器有限公司），DZG303A超纯水机（超纯水出水水质1825 MΩ·cm-2，中国台湾艾柯成都康宁实验专用纯水设备厂）。

獐牙菜苦苷（批号MUST11012401）、龙胆苦苷（批号MUST11011401）、獐牙菜苷（批号MUST11020802）、芒果苷（批号MUST10121201）、齐墩果酸（批号MUST11090502）对照品均购自成都曼斯特生物科技有限公司，纯度均≥98%。1羟基3，7，8三甲氧基口山酮、1，8二羟基3，7二甲氧基口山酮为实验室自制（纯度≥98%）。甲醇、乙腈均为HPLC级，购自TEDIA公司，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

实验材料见表1，均经大理大学药学与化学学院生药学教研室夏从龙教授鉴定，药用部位为干燥全草。

No名称拉丁名来源1青叶胆Swertia mileensis云南省红河哈尼彝族自治州弥勒2青叶胆S mileensis云南省红河哈尼彝族自治州弥勒3青叶胆S mileensis云南省红河哈尼彝族自治州弥勒4川西獐牙菜S mussotii云南省迪庆藏族自治州德钦县5川西獐牙菜S mussotii云南省迪庆藏族自治州德钦县6川西獐牙菜S mussotii云南省红河哈尼彝族自治州弥勒7印度獐牙菜S chirayita云南省迪庆藏族自治州藏医院8印度獐牙菜S chirayita云南省迪庆藏族自治州藏医院9印度獐牙菜S chirayita云南省迪庆藏族自治州藏医院10椭圆叶花锚Halenia elliptica云南省大理白族自治州宾川县11椭圆叶花锚H elliptica云南省大理白族自治州大理市苍山12椭圆叶花锚H elliptica云南省大理白族自治州云龙县13紫红獐牙菜S punicea云南省大理白族自治州大理市苍山14紫红獐牙菜S punicea云南省大理白族自治州大理市感通寺15紫红獐牙菜S punicea云南省大理白族自治州宾川县16圈纹獐牙菜S cincta云南省大理白族自治州云龙县17圈纹獐牙菜S cincta云南省大理白族自治州宾川县18圈纹獐牙菜S cincta云南省大理白族自治州大理市花甸坝19显脉獐牙菜1）S nervosa云南省大理白族自治州大理市苍山20显脉獐牙菜1）S nervosa云南省大理白族自治州宾川县21大籽獐牙菜1）S macrosperma云南省大理白族自治州大理市苍山22大籽獐牙菜1）S macrosperma云南省大理白族自治州大理市花甸坝23丽江獐牙菜1）S delavayi云南省大理白族自治州宾川县24丽江獐牙菜1）S delavayi云南省大理白族自治州宾川县25宾川獐牙菜1）S binchuanensis云南省大理白族自治州宾川县26宾川獐牙菜1）S binchuanensis云南省大理白族自治州宾川县27唐古特虎耳草1） Saxifraga tangutica 西藏自治区拉萨市注：1）由于部分藏药“蒂达”基原植物资源匮乏，不同产地、不同采收期批次不足3批（表5同）。

2方法与结果

21色谱条件及系统适用性Thermo Syncronis C18色谱柱（46 mm×250 mm， 5 μm），流动相004%磷酸水（A）乙腈（B）梯度洗脱（0～10 min，10% B；10～26 min，10～14% B； 26～40 min，14～75% B；40～70 min，75%～90% B），流速10 mL·min-1，依据各成分峰面积及分离度效果，选取最适宜吸收波长作为检测波长210 nm（齐墩果酸）， 240 nm（龙胆苦苷、獐牙菜苷、芒果苷）， 265 nm（獐牙菜苦苷、1羟基3，7，8三甲氧基口山酮、1，8二羟基3，7二甲氧基口山酮），柱温30 ℃。按7种成分色谱峰计算，理论塔板数均不低于1万，见图1。

杨晓泉等：藏药“蒂达”基原植物中主要有效成分的HPLC定量分析及其化学品质综合指数

1. 獐牙菜苦苷（swertiamarin）；2. 龙胆苦苷（gentiopicroside）；3. 獐牙菜苷（sweroside）；4芒果苷（mangiferin）；5. 1羟基3，7，8三甲氧基口山酮（1hydroxy3，7，8trimethoxyxanthone）；6. 1，8二羟基3，7二甲氧基口山酮（1，6dihydroxy3，7dimethoxyxanthone）；7. 齐墩果酸（oleanolic acid）。

图17种混合对照品（A）及青叶胆样品（B）HPLC图

Fig1HPLC chromatogram of reference substance （A）and Swertia mileensis（B）22对照品溶液的制备取獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、芒果苷、1羟基3，7，8三甲氧基口山酮、1，8二羟基3，7二甲氧基口山酮和齐墩果酸对照品适量，分别加甲醇配制成质量浓度为1685， 1310， 0745， 0730， 0136， 0144， 2225 g·L-1的溶液，即得各對照品溶液。

23供试品溶液的制备取干燥药材（全草）粉末（过60目筛）约083 g，精密称定，置10 mL试管中，加入甲醇83 mL，50 ℃条件下超声处理（功率200 W，频率59 KHz）30 min，超声3次，取上清液混合定容于25 mL量瓶，摇匀，临用前以022 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

24标准曲线的绘制将22项下各对照品溶液按3∶1∶1∶1∶1∶1∶2比例混合即得混合对照品溶液Ⅰ，再稀释10倍，即得混合对照品溶液Ⅱ。分别精密吸取混合对照品溶液Ⅰ进样30，20，15，10，5，2，1 μL，精密吸取混合对照品溶液Ⅱ进样20，10，5，2，1 μL，以峰面积（Y）为纵坐标，对照品的进样量（X，μg）为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程和相关系数，见表2。

25精密度试验精密吸取24项下混合对照品溶液Ⅰ，在21项下色谱条件连续进样6次，分别记录峰面积，计算獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、芒果苷、1羟基3，7，8三甲氧基口山酮、1，8二羥基3，7二甲氧基口山酮和齐墩果酸的峰面积的RSD分别为12%，14%，045%，14%，20%，14%，13%。表明仪器精密度良好。

26重复性试验精密称取同一批青叶胆粉末6份，制备供试品溶液，在给定色谱条件进样10 μL，分别记录峰面积，计算獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、芒果苷、1羟基3，7，8三甲氧基口山酮、1，8二

27稳定性试验将同一样品溶液隔0，15，3，45，6，12 h在给定色谱条件进样10 μL，分别记录峰面积，计算獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、芒果苷、1羟基3，7，8三甲氧基口山酮、1，8二羟基3，7二甲氧基口山酮和齐墩果酸的峰面积的RSD分别为12%，15%，19%，20%，14%，15%，070%。表明样品溶液在12 h内稳定。

28加样回收率试验取已知含量的青叶胆供试品溶液6份，添加一定量各对照品，按供试品溶液处理方法制备样品，在给定色谱条件进样10 μL。计算各成分加样回收率，结果见表3。

210数据归一化数据归一化目的在于统一各种成分的不同量纲，采用比值法进行处理，消除量纲，将不同结果数据转化为0～1的数值。本实验拟采用三角形面积法进行集成化，故把7种成分分成3组，即环烯醚萜组、口山酮组、齐墩果酸组。数据归一化计算公式见公式（1），式中I，X，O分别代表环烯醚萜系数（iridoid compounds coefficient）、口山酮系数（xanthones coefficient）、齐墩果酸系数（oleanolic acid coefficient），Ii，Xi，Oi分别代表各植物中环烯醚萜类、口山酮类、齐墩果酸含量，Imax，X max，O max分别代表环烯醚萜类、口山酮类、齐墩果酸含量最大值。

I=IiImax，X=XiXmax，O=OiOmax（1）

211化学品质综合指数计算由于各组分药效学作用不同，很难说明各组分重要性差异，故难以确定各组分权重，通过各成分加权打分量化评价[11]计算综合指数。本实验采用三角形面积法计算化学品质综合指数[9]，对环烯醚萜系数、口山酮系数、齐墩果酸系数3个维度处理，得到不同植物的化学品质内涵（即三角形面积）；最后，当3个维度数据均为1 时，该三角形面积最大，利用各样本的三角形面积除以最大三角形面积，即得化学品质综合指数（ICQI）。计算原理见图2。

3讨论

31多波长多通道检测采用多波长同时进行数据采集和记录需满足2个条件，一是要最大限度囊括全部待测组分，二是基线分离效果要好，提高检测准确度和灵敏度[11]。本实验采用多波长多通道同时检测，相较于夏从龙等[6]的分2次实验甚至2次以上实验检测多种不同吸收波长的有效物质，具有系统性强、省时、检测更完全等特点；同时由于方法最大限度囊括样品组分，可以在将样品从色谱柱中完全洗脱掉，从而不影响下一个进样的检测。

32检测波长的选择通过HPLCDAD扫描3D图谱，确定獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷和芒果苷的最大吸收波长在240 nm，1羟基3，7，8三甲氧基口山酮和1，8二羟基3，7二甲氧基口山酮的最大吸收波长在265 nm，齐墩果酸的最大吸收波长在210 nm。由于样品中獐牙菜苦苷含量很高，在最大吸收波长240 nm条件下，与相邻峰分离效果不好，且峰面积过大出现平头峰，对检测结果有影响，故选择265 nm为检测波长，分离效果和峰形更好。

33流动相和色谱柱选择本实验曾比较过文献报道[57]的多种流动相：甲醇水（二元梯度系统洗脱）系统、乙腈水（二元梯度系统洗脱）系统、甲醇004%磷酸水（二元梯度系统洗脱）系统等，经过反复多次试验，选择了21项下实验条件。同时还对Thermo Syncronis C18色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm），Thermo Syncronis C18色谱柱（46 mm×150 mm，5 μm）和Agilent C18色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm）进行比较，在本文的色谱条件下以Thermo

图3基于三维数据集成的11种藏药蒂达基原植物的化学品质综合指数（ICQI）

Fig3ICQI of eleven Dida based on integrated threedimension data

Syncronis C18色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm）分离效果最好，柱效最高。

34超声提取工艺此超声提取工艺经过L9（34）正交实验设计[13]，以7种化学成分与本药材功能相关性大小确定权重系数，通过计算综合评分[=（X1含量/最大X1含量）×100×权重系数1+…+（Xn含量/最大Xn含量）×100×权重系数n]作为正交试验的评价指标，采用Excel软件处理[14]计算K及方差分析，确定最佳超声提取工艺，经验证该工艺提取效果好、方便、合理、可行。

35唐古特虎耳草实验结果表明唐古特虎耳草中无齐墩果酸成分，这一结果与阳勇等[15]的薄层鉴别的结果一致。有关虎耳草属植物中含有环烯醚萜类及口山酮类成分未见报道，但吴瑞[16]整理虎耳草属植物的化学成分时具有丰富的黄酮、黄酮苷及萜类，本研究中使用HPLCDAD扫描3D图谱，唐古特虎耳草供试品色谱图中，在与对照品色谱图中保留时间相同位置上出现相同的色谱峰，供试品和对照品对应色谱峰的UV光谱谱型、最大吸收波长一致，可鉴定为同一物质。

36含量测试结果通过测试结果发现11种藏药蒂达基原植物中7种成分含量差异较大，獐牙菜苦苷从0455～139460 mg·g-1，丽江獐牙菜最高，青叶胆次之；龙胆苦苷从0134～80955 mg·g-1，川西獐牙菜最高，椭圆叶花锚未检出；獐牙菜苷从0100～7279 mg·g-1，大籽獐牙菜最高，唐古特虎耳草最低；芒果苷从0019～39925 mg·g-1，川西獐牙菜最高，唐古特虎耳草最低；1羟基3，7，8三甲氧基口山酮从0027～1631 mg·g-1，椭圆叶花锚最高，唐古特虎耳草最低；1，8二羟基3，7二甲氧基口山酮从0007～1300 mg·g-1，川西獐牙菜最高，唐古特虎耳草最低；齐墩果酸从0491～24239 mg·g-1，青叶胆最高，唐古特虎耳草最低。综合考虑，青叶胆、川西獐牙菜、紫红獐牙菜、椭圆叶花锚中7种有效成分相对较高，值得进一步研究开发。圈纹獐牙菜、丽江獐牙菜中分别龙胆苦苷和獐牙菜苦苷含量较高，适合用于提取该成分，进行进一步开发利用。唐古特虎耳草为西藏购买，估计由于采收期等原因，故有效含量偏低。

37化学品质综合指数（ICQI）结果从三角形面积可以直观看出，川西獐牙菜最大，青葉胆、紫红獐牙菜、椭圆叶花锚次之，唐古特虎耳草几乎不可见。通过ICQI计算，其中最高的川西獐牙菜ICQI达到（0424 3±0202 8），某一批次可达0568 1；青叶胆、紫红獐牙菜、椭圆叶花锚次之，平均值分别为（0341 6±0005 0），（0230 8±0047 2），（0208 9±0046 5）；唐古特虎耳草只有0000 1。此结果与含量分析结果相同，且川西獐牙菜、青叶胆、紫红獐牙菜、椭圆叶花锚正是作为藏药“蒂达”在民间最广泛使用的基原植物，与传统对藏药“蒂达”的认识保持一致。虽然化学品质综合指数（ICQI）只是一个相对数值，但因其综合反映多种有效成分的含量，对质量标准有积极的参考价值。

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[责任编辑丁广治]