基于DPPH、ABTS和FRAP的中药女贞子抗氧化谱效关系研究

李昌勤 姚辰 朱荣遥 黄勇鑫 康文艺 王金梅

[摘要]运用HPLC测定不同加热条件处理的女贞子药材的特征图谱，通过DPPH、ABTS和FRAP法测定不同条件处理女贞子的抗氧化能力，运用偏最小二乘法进行数据分析，研究女贞子量化特征图谱和抗氧化活性的相关性，探讨女贞子抗氧化活性的物质基础，并筛选活性色谱峰。从35个匹配特征图谱中筛选出S1，S2，S15，S24，S27，S29，S32，S33，S35与女贞子清除DPPH自由基能力呈显著正相关；S1，S2，S5，S8，S16，S27，S33与女贞子清除ABTS自由基显著正相关；S12，S20，S22，S28，S30，S31，S32，S34与女贞子还原Fe3+能力显著正相关。其中S1，S2，S27，S33与女贞子清除DPPH自由基、ABTS自由基均正相关，S32与女贞子清除DPPH自由基、还原Fe3+能力均正相关。通过与对照品比对确定了S3为红景天苷、S19为木犀草苷、S21为特女贞苷、S22为橄榄苦苷、S23为女贞苷、S33为木犀草素、S34为芹菜素。试验结果表明特女贞苷和红景天苷等虽是规定的表征女贞子药材优劣的指标成分，但女贞子药效并不是靠个别成分含量决定。通过分析与药效相关的化合物群的含量才能真实反映药材的质量。

[关键词]女贞子； 抗氧化活性； 偏最小二乘法； 谱效关系

[Abstract]Characteristic chromatogram of Ligustri Lucidi Fructus which were processed by heat treatment with different temperatures and times was developed by HPLC DPPH， ABTS and FRAP assays were performed to determine the antioxidant activity The spectrumeffect correlation was studied using Partial Least Squares（PLS）to explore the active ingredients of Ligustri Lucidi Fructus by investigating the relationship between HPLC spectrum and antioxidant activity S1， S2， S15， S24， S27， S29， S32， S33 and S35 were characteristic compounds in 35 matching characteristic chromatograms which were positive relationship with scavenging DPPH free radical activity S1， S2， S5， S8， S16， S27 and S33 were significantly positively related to scavenge ABTS free radical activity S12， S20， S22， S28， S30， S31， S32 and S34 were significantly positively related to restore Fe3+ activity Among the chromatographic peaks， S1， S2， S27 and S33were positively related to scavenge DPPH free radical and ABTS free radical activity， and S32 was positively related to scavenge DPPH free radical and restore Fe3+ activity S3， S19， S21， S22， S23， S33 and S34 were determined as salidroside， luteolin7Oglucoside， specnuezhenide， oleuropein， ligustroflavone， luteolin andapigenin， respectively The results showed that although specnuezhenide and salidroside were stipulated index compounds to evaluate the quality of Ligustri Lucidi Fructus， the Ligustri Lucidi Fructus pharmcodynamic effect did not depend on the contents of those index components The quality of traditional Chinese medicines（TCMs）should be determined by the compound groups associated with pharmcodynamic effect

[Key words]Lucidi Ligustri Fructus； antioxidant activity； partial least squares； spectrumefficacy

doi：104268/cjcmm20160917

女貞子为木犀科女贞属植物女贞Ligustrum lucidum Ait的干燥成熟果实，性凉，味甘、苦，归肝、肾经，具有滋补肝肾、明目乌发的功效，临床上多用于肝肾阴虚，眩晕耳鸣，腰膝酸软，须发早白，目暗不明，内热消渴，骨蒸潮热等证[1]。女贞子主要含有萜类、黄酮类、苯乙醇苷类、挥发油、脂肪酸类和氨基酸类等化学成分[2]。药理学研究显示具有保肝、强心、抗炎、抑菌、抗病毒、抗癌、提高免疫力、抗衰老、降血糖和降血脂等作用[2]。

癌症、心脑血管疾病等与机体某些内源性自由基导致的生物大分子如蛋白质、核酸和DNA不可逆的氧化损伤密切相关，尤其是活性氧如超氧阴离子自由基、羟基自由基和脂质自由基等[34]。研究表明，女贞子不同提取部位均有较好的抗氧化活性[58]。

女贞子化学成分复杂，化学成分与活性量效关系尚不清楚，且女贞子指标性成分特女贞苷等有效成分会在贮藏过程中发生变化[9]，继而影响其临床治疗。中药“谱效关系”研究能使中药活性成分整体特征精细表达与多指标、多靶点的作用机制紧密联系，符合中药作用特点，可合理确定中药药效物质基础[10]。因此，本文采用经典恒温加速法对女贞子药材进行处理，以研究女贞子药材化学成分变化下与药理活性相应的变化规律，并通过偏最小二乘回归分析方法筛选出女贞子药材与抗氧化作用相关的色谱峰，为女贞子药材资源的质量控制及进一步开发利用奠定基础。

1材料

岛津LC20AT高效液相色谱系统，LC solution色谱工作站（日本岛津株式会社）。InertSustain RPC18色谱柱（46 mm×150 mm，5 μm）；Multiskan MK3全波长酶标仪（美国Thermo Electron公司）；GRP9270隔水式恒温培养箱（上海森信实验仪器有限公司）；KQ500DB超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；SB2000旋转蒸发仪（日本东京理化株式会社）；VORTEX6漩涡混合器（海门市其林贝尔仪器有限公司）；DHG9053A电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司），AB135S型1/10万级电子天平（梅特勒托利多仪器有限公司，瑞士）。

DPPH（1，1diphenyl2picrylhydrazyl，日本东京化成工业株式会社），2，2′连氨（3乙基苯并噻唑啉6磺酸）二氨盐（ABTS，美国Fluka公司）；Fe3+三吡啶三亚嗪（TPTZ，比利时Acros organics公司）；二丁基羟基甲苯（butylatedhydroxytoluene，比利时Acros organics公司，BHT）；没食子酸丙酯（propyl gallate，比利时Acros organics公司，PG）；丁基羟基茴香醚（butylatedhydroxyanisole，比利时Acros organics公司，BHA）；甲醇（美国Fisher公司，色谱纯），乙腈（美国Fisher公司，色谱纯），水为娃哈哈纯净水；其他试剂均为分析纯。

女贞子药材2013年冬至后采集于河南大学金明校区植物园，经河南大學中药研究所李昌勤教授鉴定为木犀科植物女贞L lucidum的干燥成熟果实，标本存放于河南大学中药研究所。

2方法

21经典恒温加速试验

将均匀分装好的48份女贞子样品称重后均匀置于50，60，70，80 ℃恒温干燥箱（恒温±02 ℃）中，根据样品存放温度不同，每个温度段设定相应4个时间点，每个时间点3个平行，并在规定时间内取出样品，立刻冷却至室温，称重，备用。

22样品溶液制备

按照文献[9]，将加速试验后的女贞子捣碎，取女贞子碎片2 g，精密称定，每个样品做3个平行，分别加入药材10倍量的水，浸泡30 min后煎煮回流30 min，2层纱布趁热过滤，药渣加药材6倍量的水，煎煮回流30 min，2层纱布趁热过滤，用力挤干，合并两次滤液，放凉后置50 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，过022 μm滤膜，即得。

23 DPPH法

参照文献[1112]，将10 μL样品溶液和175 μL 200 μmol·L-1的DPPH溶液先后加入至96微孔板中，置阴暗处反应20 min后，用酶标仪在492 nm处测定A。每份样品平行操作3次，取平均值，计算出清除率，并运用SPSS 190软件进行probit回归，预测样品的IC50。

24ABTS法

参照文献[13]，将ABTS配制成7 mmol·L-1的水溶液，与配制成的245 mmol·L-1的K2S2O8水溶液混合，使用前在暗处放置12 h以上，使用时用甲醇稀释使吸光度在734 nm处为078～082，待用。取10 μL样品加入200 μL ABTS自由基工作液混匀测定A。每份样品平行3次，取平均值，计算出清除率及半数抑制率IC50。

25FRAP法

参照文献[14]，取10 μL样品加入到96微孔板中，加入200 μL新鲜配制的TPTZ工作液，混匀，37 ℃暗处反应30 min后，用酶标仪在595 nm处测定A。每份样品平行测定3次，取平均值。测定不同浓度的Trolox吸光度绘制标准曲线，样品抗氧化结果以Trolox当量（mmol·g-1）表示。

26女贞子药材特征图谱分析

色谱条件为InertSustain RPC18色谱柱（46 mm×150 mm，5 μm），流动相甲醇（A）02%冰乙酸水溶液（B）梯度洗脱（0～18 min，20%～26% A；18～30 min，26%～30% A；30～50 min，30%～35% A；50～60 min，35% A；60～72 min，35%～44% A；72～120 min，44%～50% A；120～125 min，50%～100% A；125～150 min，100% A），流速06 mL·min-1，检测波长240 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL，测定。见图1。

27数据分析

本试验采用偏最小二乘回归分析方法对女贞子量化特征图谱数据和抗氧化活性数据分别进行分析。分析前，采用中国药典委员会推荐的软件《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004 10 A版》对特征图谱的各峰保留时间进行校正，并对其峰面积进行标准化处理，得到量化特征峰的数据。采用DPS705分析软件，以色谱峰面积为自变量（X），抗氧化活性数据为因变量（Y），建立偏最小二乘回归方程，分别筛选出与清除DPPH自由基、清除ABTS自由基和还原Fe3+能力显著相关的色谱峰。

3 结果

31女贞子药材抗氧化活性测定结果

不同加速温度及时间点的女贞子样品清除DPPH，ABTS自由基的IC50和还原Fe3+能力的Trolox当量值，见表1。

32量化色谱峰的确定

用软件《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004 10 A版》，以女贞子药材生品水煎液色谱图为参照谱，时间窗口05 min，选择各图谱中均含有且峰形相对较好的色谱峰位进行多点校正，釆用平均数法生成对照图谱。结果17张特征图谱匹配出个79共有峰。由于女贞子样品中所含部分化合物随经典恒温加速试验差异变化不大。某些微量成分也有可能也对抗氧化活性产生影响，故将部分峰形较好，但含量较低的色谱峰也纳入考察范围。最终选择35个色谱峰作为研究对象，见图2。女贞子药材特征图谱色谱峰匹配数据见表2。

33谱效关系的偏最小二乘回归分析

331偏最小二乘回归方程的建立以女贞子各样品的抗氧化活性数据作为因变量，样品量化特征图谱色谱峰信息作为自变量，利用DPS705统计软件对数据进行Zscore标准化处理，然后对其进行偏最小二乘回归分析，见图3，数据标准化后模型误差平方和r2随潜在因子增加逐渐增大又减小，在潜在因子达到16时，R2达到最大，分别解释自变量方差8686%，8735%，9744%，并得到3个回归方程，如下。

332变量投影重要性分析结果见图4。自变量的标准化回归系数的绝对值越大，则该自变量对因变量的影响就越显著[15]。若标准化回归系数为正，该自变量与因变量呈正相关，反之则为负相关。VIP（变量投影重要性）图的纵坐标值越大，说明该自变量对相应因变量的贡献越大。

偏最小二乘回归结果表明：S1，S2，S15，S24，S27，S29，S32，S33，S35与DPPH法IC50的相反数呈正相关且其回归系数绝对值和VIP值较大，当它们含量增加时，样品清除DPPH自由基的能力增强，其中S27，S29，S32，S33，S35更有统计意义；S13，S14，S21，S22，S26，S34与DPPH法IC50的相反数呈负相关且其回归系数绝对值和VIP值较大，当它们含量增加时，样品清除DPPH自由基的能力减弱，其中S21，S34更有统计意义。

S1，S2，S5，S8，S16，S27，S33与ABTS法IC50的相反数呈正相关且其回归系数绝对值和VIP值较大，当它们含量增加時，样品清除ABTS自由基的能力增强，其中S2，S5，S33更有统计意义；S13，S14，S20，S21，S22，S24，S34与ABTS法IC50的相反数呈负相关且其回归系数绝对值和VIP值较大，当它们含量增加时，样品清除ABTS自由基的能力减弱，其中S13，S14，S21，S22，S24更有统计意义。

S12，S20，S22，S28，S30，S31，S32，S34与FRAP法的Trolox当量值呈正相关且其回归系数绝对值和VIP值较大，当它们含量增加时，样品还原三价铁离子的能力增强，其中S20，S22，S30，S31，S32更有统计意义；S11，S13，S15，S25，S33与FRAP法的Trolox当量值呈负相关且其回归系数绝对值和VIP值较大，当它们含量增加时，样品还原三价铁离子的能力减弱，其中S25更有统计意义。

34色谱峰成分鉴定

文献报道[16]，不同来源的女贞子水煎液中均含有红景天苷、酪醇、特女贞苷、木犀草苷、木犀草素、芹菜素等有效成分。结合本课题组现有条件，采用文献中报道的成分的对照品在HPLC上进样，匹配出峰3为红景天苷、峰19为木犀草苷、峰21为特女贞苷、峰22为橄榄苦苷、峰23为女贞苷、峰33为木犀草素、峰34为芹菜素，色谱图见图5。

4 讨论

文献报道，红景天苷、木犀草苷等7种成分均有显著的体外抗氧化活性[1924]，但本研究仅筛选出橄榄苦苷、木犀草素和芹菜素具有抗氧化作用。其中，橄榄苦苷和木犀草素与女贞子清除DPPH和ABTS自由基能力呈正相关，对Fe3+还原能力呈负相关，而芹菜素仅与女贞子的Fe3+还原能力呈正相关。中药的药效并不仅仅是基于某个或几种化合物，而可能是基于一个或几个化合物或微量成分的化合物群，而在贮存或处理的过程中，这些化合物群相互之间可能会进行此消彼长的可逆或不可逆的转化，在这种转过过程中，药效也在进行相应的变化。

文献检索发现，已报道的中药材饮片“谱效关系”的研究均是基于不同产地、不同采收期、不同来源的药材而进行的[15，2528]。而同种药材在长期的地域化差异下，会有很多变种，那么相应所含的化学成分和微量元素含量也有差别。在这种情况下进行的“谱效关系”研究是否忽略了某些细微的但可能起决定因素的信息？结果是否可信？“谱效关系”研究是否能基于同一来源的药材或饮片而排除上述干扰因素进行？课题组前期采用经典恒温加速试验对中药的有效期进行过研究，发现经加速后的药材或饮片中的有效成分均有不同程度的变化[2930]。因此，本文采用经典恒温法对药材进行差异化前处理，以对女贞子药材的药效物质基础进行准确的筛选。

偏最小二乘回归是典型的谱效关系研究常用数据处理方法，其融合了主成分分析、典型相关分析和多元线性回归分析这三种分析手段，能够在模型自变量存在严重多重相关性且样本量较少的情况下进行回归分析。偏最小二乘回归拟合的数学模型包含了原有自变量的信息，更容易判别系统信息与“噪声”，甚至是非随机性的“噪声”。因此，偏最小二乘回归在分析类似于中药特征图谱这样小样本、高维度的数据时有独特的优势。

本文虽然筛选出了女贞子不同机制的抗氧化活性相关色谱峰，但尚不完全了解其结构特征。下一步将通过质谱等手段对其进行结构鉴定，以进一步辨识出女贞子的相关药效物质基础，为女贞子药材资源的质量控制及进一步开发利用提供理论依据。

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[责任编辑丁广治]