铁皮石斛内生真菌对宿主组培苗生长与代谢成分的影响

2016-07-09朱波刘京晶斯金平秦路平韩婷赵鹂吴令上

中国中药杂志 2016年9期

朱波刘京晶斯金平秦路平韩婷赵鹂吴令上

[摘要]为揭示初筛所得7株活树附生铁皮石斛内生真菌对宿主生长及代谢成分的影响，该研究观察测量了接菌与未接菌铁皮石斛组培苗形态特征与农艺性状，采用苯酚硫酸法与热浸法测定组培苗茎总多糖含量与浸出物含量，柱前衍生HPLC分析茎多糖中单糖组成，HPLC分析茎醇溶性成分。研究表明，供试7个菌株可改变铁皮石斛组培苗茎节变紫进程，并影响茎糖类及醇溶性成分组成及含量积累，除DO34外均能促进组培苗生长与提高多糖含量，除DO12外均能促进甘露糖含量积累，DO18，DO19，DO120可促进醇溶性浸出物含量积累，综合生长及代谢成分多项指标筛选出DO14，DO18，DO19与DO120 4个优良菌株，为铁皮石斛内生真菌和宿主相互作用机制研究与微生物工程研究提供了菌种材料与研究基础。

[关键词]铁皮石斛；内生真菌；生长发育；代谢成分

[Abstract]The paper aims to study the effects of endophytic fungi from D officinale cultivated on living trees on growth and components metabolism of tissue culture seedlings Morphological characteristics and agronomic characters of tissue culture seedlings infected and uninfected by endophytic fungus were observed and measured Polysaccharides and alcoholsoluble extracts contents were determined by phenolsulfuric acid method and hotdipmethod， respectively Monosacchride composition of polysaccharides and alcoholsoluble extracts components were analyzed by precolumn derivatives HPLC and HPLC method， respectively It showed that effects of turning to purple of stem nodes could be changed by endophytic fungus Besides， the endophytic fungus could affect the contents and constitutions of polysaccharides and alcoholsoluble extracts The strains tested， expect DO34， could promote growth and polysaccharides content of tissue culture seedlings The strains tested， expect DO12， could promote the accumulation of mannose Furthermore， DO18， DO19 and DO120 could increase alcoholsoluble extracts On the basis， four superior strains were selected for mechanism research between endophytic fungus and their hosts and microbiology engineering

[Key words]Dendrobium officinale； endophytic fungi； growth and development； components metabolism

doi：10.4268/cjcmm20160906

中藥材的品质与其生长环境密切相关，生长环境包括生物性因素与非生物性因素，植物内生真菌作为一个重要的生物性因素已经越来越受到国内外学者的关注[14]，现有研究表明植物内生真菌能促进宿主生长、提高宿主对生物胁迫或非生物胁迫的抗性[5]，能参与宿主次生代谢产物的合成和积累，影响药用植物的品质[67]。

铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo是我国传统名贵中药材，具有益胃生津、滋阴清热等功效，用于热病津伤，口干烦渴，胃阴不足，食少干呕等症，收载于2015年版《中国药典》[8]。近年来，铁皮石斛内生真菌研究引起国内外学者的关注，但主要集中在内生真菌分离纯化、菌根真菌对植物种子萌发与幼苗生长的促进作用等方面[917]，从形态特征、农艺性状与代谢成分等方面系统评价铁皮石斛内生真菌与宿主间相互关系的研究鲜有报道。本试验在前期初筛所得内生真菌的基础上，评价内生真菌对组培苗生长发育与代谢成分的影响，筛选优良菌株，为研究内生真菌与宿主相互作用机制，改良铁皮石斛药材品质提供了一条新的途径。

1材料

供试菌株来自本课题组前期从不同活树附生铁皮石斛中分离的内生真菌菌株，菌株编号为DO12，DO14，DO18，DO19，DO34，DO38，DO120（表1）。供试铁皮石斛组培苗为D6品系，由浙江农林大学国家林业局铁皮石斛工程技术研究中心选育。

2方法

21形态特征观察

将备选菌株用接种针从斜面保存试管中挑出，接入含有PDA培养基的平板上，放入霉菌培养箱中暗培养（25 ℃），待菌丝长满平板后，用5 mm打孔器打成均匀小块，接种至铁皮石斛组培苗中，每瓶苗接1个菌块，每个菌株接种组培苗30瓶。接种后，统计组培苗茎段出现紫色瓶数（以单株茎节变紫为标准），计算紫色茎节比例=紫色茎节瓶数/总瓶数×100%，不接菌的组培苗作为对照。

22农艺性状考察

将培养到一定阶段的组培苗取出，洗去培养基，用纸巾擦拭干净进行农艺性状考察。用直尺测量每株幼苗的苗高与根长，用游标卡尺测量茎基部粗、茎中部粗、叶长（叶片中脉长）与叶宽，计算叶长宽比=叶长/叶宽，统计每株苗根数、叶片数与萌条数，用电子天平称量接种组培苗茎鲜重与叶总鲜重，将茎与叶放置60 ℃烘箱烘干至恒重，分别称量茎与叶干重。每个处理测200株苗，每株苗取顶端3片叶进行考察，叶面积参考刘志高等[18]的方法估算。

23组培苗代谢成分分析

将烘至恒重的茎与叶样品粉碎，过60目筛，待用。茎总多糖含量测定采用苯酚硫酸法[19]，标准曲线方程为Y=0012X-002，R2=0999 5，X为浓度，Y为吸光度，3次重复；参考俞巧仙等[20]的方法测定茎醇溶性浸出物，3次重复；茎醇溶性高效液相色谱条件：采用XB C18色谱柱（46 mm×250 mm，05 μm），25 ℃柱温，流动相为纯水（C）乙腈（D），采用梯度洗脱，检测波长为280 nm，进样量为10 μL；单糖衍生参照苑鹤等[21]的方法。用SPSS 170软件处理数据，采用单因素ANOVA分析，两两比较采用LSD法。

3结果与分析

31内生真菌对组培苗形态特征的影响

接种内生真菌的组培苗生长一段时间后，茎段会出现茎节变紫现象，出现的数量、时间与对照存在明显差异（图1）。接种DO38的组培苗茎节变紫最早，接种后第4天即有变紫现象出现；接种DO14，DO18，DO19的组培苗，茎节在第5天开始变紫，接种上述4个菌株的组培苗茎节变紫时间均比CK提前，数量比CK增加；不论是否接种内生真菌，多数组培苗第16～19天茎节变紫数量最多，随后紫色逐渐褪去，但接种DO38与DO19的组培苗紫色茎节比例基本保持不变，见图1。

32内生真菌对组培苗农艺性状与产量的影响

供试组培苗接种内生真菌后，农艺性状间存在极显著差异（表2，P<001），其中接种DO12，DO19苗高，接种DO14，DO18，DO19，DO34，DO38，DO120苗粗，接种DO12，DO18，DO19，DO38，DO120叶面积均极显著高于CK（表2，P<001）；茎总鲜重与总干重最高为接种DO19组培苗，分别为1273，1040 g；铁皮石斛产量指标为茎段，除接种DO34组培苗茎总鲜重低于CK组外，其余6个菌株组培苗产量指标均高于CK。根据主要农艺性状与产量指标，接种DO12，DO18，DO19与DO120组培苗表现较好，表现出苗高，茎粗，叶片大，茎分枝少，根系生长适中等特点。

33内生真菌对组培苗代谢成分的影响

331茎总多糖与醇溶性浸出物含量的差异接种不同菌株的组培苗茎总多糖与醇溶性浸出物含量存在极显著差异（表3，P<001）。接种供试菌株的组培苗茎总多糖含量均极显著高于CK（P<001），其中接种DO19组培苗茎总多糖质量分数最高（1486%），是CK的296倍；接种DO18，DO19，DO34组培苗茎醇溶性浸出物含量极显著高于CK（P<001），其中DO19组培苗茎醇溶性浸出物质量分数最高（1041%），是CK组的119倍。

332多糖中单糖组成的差异未接菌的CK组培苗茎多糖衍生后检测出4种单糖成分，分别为甘露糖，葡萄糖，半乳糖与阿拉伯糖，接种内生真菌后，组培苗单糖组成发生变化（表4，图2）。接种DO12，DO18，DO19，DO34与DO38组培苗除4种单糖组分与CK相同外，还检测出木糖成分；而接种DO14与DO120的组培苗单糖组成比CK少，接种DO14的组培苗只检测出甘露糖与葡萄糖，接种DO120的组培苗只检测出甘露糖，葡萄糖與阿拉伯糖。甘露糖是铁皮石斛多糖的主要组分，除DO12外接种其他菌株的组培苗甘露糖峰面积均高于CK，其中接种DO19的组培苗峰面积最高，是CK的261倍。

333茎醇溶性成分差异接种内生真菌的铁皮石斛组培苗茎醇溶性成分发生变化，HPLC差异特征峰（表5）可知，接菌后的组培苗中共有21个HPLC差异特征峰均比CK多，其中接种DO19的组培苗特征峰最多，达14个，其次为接种DO18，DO120，DO14的组培苗，分别为11，11，9个。在这些特征峰中，3，13，15，18，19，20号峰表现为峰面积大，分离度较好或为单一特征峰，可进一步重点分析（图3）。

4结论与讨论

供试的7个备选菌株对铁皮石斛组培苗形态特征、农艺性状、产量指标及主要代谢成分等方面均有不同程度的影响，除DO12菌株外其余6个菌株均促进了组培苗茎节变紫进程，且接种该6个菌株组培苗茎总多糖含量均极显著高于CK（P<001），可能茎段颜色与总多糖含量存在相关性，茎段紫红色越明显，多糖含量越高[2223]。综合接种内生真菌后组培苗农艺性状，茎总多糖，浸出物与甘露糖峰面积，茎醇溶性成分特征峰等指标，筛选出DO14，DO18，DO19与DO120 4株优良菌株，均能明显促进组培苗生长发育，茎鲜重分别提高56%，44%，649%，14%，茎中总多糖含量提高1137%，707%，1960%，1574%，甘露糖含量提高422%，1058%，1607%，1320%，其中接种DO18，DO19菌株还可分别提高茎中浸出物含量43%，63%。

为了进一步揭示内生真菌对组培苗代谢成分的影响规律，从茎节颜色变化分析代谢成分动态变异规律，拟选择临界时间点进行转录组学分析，从而阐释铁皮石斛代谢成分变化的分子机制。目前铁皮石斛水溶性与醇溶性成分鉴定相关报道较少，药效成分不够明确，本试验初步探索了接种内生真菌后组培苗茎醇溶性成分变化，检测出6个HPLC特征差异峰，可优先选择高分辨质谱技术进一步分析，通过相对分子质量初步鉴定可能成分，为阐明内生真菌影响铁皮石斛醇溶性成分变化机制提供基础。

[参考文献]

[1]Petrini O， Fisher P. Occurrence of fungal endophytes in twigs of Salix fragilis and Quercus robur[J]. Mycol Res，1990，94 （8）：1077.

[2]万德光. 中药品质研究：理论、方法与实践[M]. 上海：上海科学技术出版社，2008：35.

[3]蔡少青. 生药学[M]. 上海：人民卫生出版社，2007：93.

[4]Petrini O. Fungal endophytes of tree leaves. Microbial ecology of leaves[M]. New York： SpringerVerlag，1991：197.

[5]PorrasAlfaro A，Bayman P. Hidden fungi，emergent properties： endophytes and microbiomes [J]. Annu Rev Phytopathol， 2011，49：291.

[6]Mucciarelli M， Camusso W， Maffei M. Volatile terpenoids of endophytefree and infected peppermint （Menthapiperita L. ）： chemical partitioning of a symbiosis [J]. Microb Ecol，2007，54（4）：685.

[7]史應武，娄恺，李春. 内生真菌对甜菜主要农艺性状及氮糖代谢关键酶活性的影响[J]. 作物学报，2009，35（5）：946.

[8]中国药典. 一部[S]. 2015.

[9]陈晓梅，肖盛元，王春兰，等. 真菌诱导子处理的铁皮石斛原球茎HPLCMS指纹图谱分析[J]. 中国药学杂志，2008，43（24）：1859.

[10]胡克兴，侯晓强，郭顺星. 铁皮石斛内生真菌分布[J]. 微生物学通报，2010，37（1）：37.

[11]吴慧凤，宋希强，胡美姣. 铁皮石斛促生内生真菌的筛选与鉴定[J]. 西南林业大学学报，2011，31（5）：47.

[12]高微微，郭顺星. 内生真菌菌丝及代谢物对铁皮石斛及金线莲生长的影响[J]. 中国医学科学院学报，2001，23（6）：556.

[13]金辉，亢志华，陈晖，等. 菌根真菌对铁皮石斛生长和矿质元素的影响[J]. 福建林学院学报，2007，27（1）：80.

[14]金辉，许忠祥，陈金花，等. 铁皮石斛组培苗与菌根真菌共培养过程中的相互作用[J]. 植物生态学报，2009，33（3）：433.

[15]郭顺星，曹文芩，高微微. 铁皮石斛及金钗石斛菌根真菌的分离及其生物活性测定[J]. 中国中药杂志，2000，25（6）：338.

[16]侯丕勇，郭顺星. 真菌对铁皮石斛原球茎酶活性和胞外pH的影响[J]. 微生物学通报，2004，31（2）：26.

[17]舒莹. 内生真菌MF24对铁皮石斛原球茎诱导作用及石斛的化学成分和活性研究[D]. 北京：中国协和医科大学，中国医学科学院，2005.

[18]刘志高，朱波，斯金平，等. 铁皮石斛F1代苗期农艺性状研究[J]. 中国中药杂志，2013，38（4）：498.