PA-MSHA对脓毒症/严重脓毒症大鼠肠道ICAM-1、VCAM-1表达的影响

方喆琦，李新宇，魏玉英，安宗仁，段　越，于　洋



PA-MSHA对脓毒症/严重脓毒症大鼠肠道ICAM-1、VCAM-1表达的影响

方喆琦1，李新宇2，魏玉英2，安宗仁1，段越1，于洋1

【摘要】目的研究铜绿假单胞菌甘露糖敏感血凝菌毛株（pseudomonas aeruginosa-mannose sensitive hemagglutinin，PAMSHA）预给药对脓毒症/严重脓毒症大鼠肠道细胞间黏附分子-1（intercellular cell adhesionmolecule-1，ICAM-1）及肠血管细胞间黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1）表达的影响。方法SPF级雄性SD大鼠共40只，随机分为5组，空白组、脓毒症组、严重脓毒症组给予生理盐水注射液皮下注射0.3 ml/d，PA-脓毒症组、PA-严重脓毒症组预先PA-MSHA皮下注射0.3 ml/d，连续给药7 d，第8天根据Gonnert人粪便悬液腹腔注射法改良制造大鼠脓毒症/严重脓毒症模型。成模后监测生命体征，留取一部分肠组织，制作普通病理切片苏木精-伊红（hematoxylin-eosinstaining，HE）染色鉴定，另取部分肠组织并用酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbentassay，ELISA）大鼠肠ICAM-1、VCAM-1表达水平。结果（1）HE染色结果显示与空白组对比，各组均发生形态改变；（2）五组之间肠道ICAM-1（F=33.337，P＜0.001）、VCAM-1（F=12.714，P＜0.001）表达水平差异有统计学意义；（3）进一步比较ICAM-1表达水平可知，脓毒症组表达水平高于PA-脓毒症组（P＜0.05），严重脓毒症组表达水平低于PA-严重脓毒症组（P＜0.05）；（4）比较VCAM-1表达水平，脓毒症组表达水平高于PA-脓毒症组（P＜0.05），严重脓毒症组表达水平与PA-严重脓毒症组相比差异无统计学意义（P=0.262）。结论（1）腹腔感染导致的脓毒症/严重脓毒症均可使大鼠肠道ICAM-1、VCAM-1表达水平升高；（2）PA-MSHA预给药能抑制脓毒症大鼠肠道ICAM-1、VCAM-1的表达水平；（3）在严重脓毒症大鼠组中，所测得ICAM-1和VCAM-1水平不能准确反映出PA-MSHA对其作用，可能与肠上皮细胞和炎性细胞大量坏死有关。

【关键词】脓毒症；铜绿假单胞菌甘露糖敏感血凝菌毛株；细胞间黏附分子-1；血管细胞粘附分子-1

E-mail: 124617095@qq.com

作者单位： 1.832003，新疆石河子大学医学院临床医学院；
2.830000，新疆军区乌鲁木齐总医院重症医学科

脓毒症是指宿主存在严重的、危及生命的感染和器官功能障碍，机体对病原体做出不恰当的免疫反应引起的全身炎性反应综合征（systemic inflammatory response syndrome， SIRS）［1]。Angus等［2]研究表明脓毒症已成为重症监护病房非心脏患者死亡的主要原因。腹腔感染导致的脓毒症并发多器官功能障碍 （multiple organ dysfunction syndrome， MODS）也是外科重症监护病房患者常见的死亡原因之一［3]。炎性细胞向感染部位移行是其发挥抗感染作用的重要前提，细胞间黏附分子在其中发挥了重要作用，ICAM-1、VCAM-1均属于CAM免疫球蛋白超家族中的成员。脓毒症时，活化的内皮细胞表面的ICAM-1和VCAM-1可与相应配体相结合，介导炎性细胞与内皮细胞的黏合作用，这是炎性细胞募集至感染部位的重要前提。

PA-MSHA是牟希亚教授用生物工程技术培育的具有双向免疫调节及杀伤肿瘤细胞作用的生物药品［4]，目前已广泛应用于临床肿瘤辅助治疗。已有实验表明，PA-MSHA可降低感染小鼠的病死率［5]，其参与抗感染过程机制也成为近年研究的热点。笔者通过研究预防性给予PA-MSHA对脓毒症/严重脓毒症大鼠肠道ICAM-1和VCAM-1的影响，探讨PA-MSHA对脓毒症的预防作用，为PA-MSHA在抗感染领域的应用提供实验依据。

1　材料与方法

1.1材料实验动物选取健康清洁SPF级雄性SD大鼠共40只，体重250～300 g，由新疆医科大学动物实验中心提供［生产许可证编号：SCXK（新）2011-0004］。

1.2仪器与试剂AF-858型自动酶标分析仪（上海安泰分析仪器有限公司）；LXJ-IIB型离心机（上海安亭科学仪器厂）；纯水仪（美国Hi-tech Instruments产品）；分析天平（Denver Instrument）；制冰机（厦门国仪 GYXH-155）。PA-MSHA（北京万特尔生物制药有限公司）；巯基乙酸钠、硫酸钡（国药集团化学试剂有限公司）；过氧化氢酶（SIGMA）；甘油（AMERSCO）；戊巴比妥钠（MERCK）；不含乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid， EDTA）蛋白酶抑制药（ROCHE）； 苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride， PMSF） （BIOSHARP）；Rat ICAM-1 ELISA 试剂盒（上海巧伊）；Rat VCAM-1 ELISA 试剂盒（武汉贝英莱）。所有试剂均在有效期内使用。

1.3实验方法及分组按随机数表法将SD大鼠随机分为5组，每组8只：（1）空白组；（2）脓毒症组；（3）PA-脓毒症组；（4）严重脓毒症组；（5）PA-严重脓毒症组。连续给药7 d，空白组、脓毒症组、严重脓毒症组分别给予0.9 %氯化钠注射液0.3 ml/（只·d）背部皮下注射；PA-脓毒症组、PA-严重脓毒症组分别给予PA-MSHA 0.3 ml/（只·d ） 背部皮下注射（注：PAMSHA含菌1.6～2.0×109/ml）。

根据Gonnert人粪便悬液腹腔注射法改良［6]，制造粪便混悬液。收集并混合3个健康非素食成人的粪便，迅速按1∶1（V/V）稀释于预先配置的巯基乙酸盐悬液（14.5 g巯基乙酸盐，50 g硫酸钡，500 ml双蒸水） 中以优化细菌生长，加入过氧化氢酶（0.019 mg/100 ml）以灭活活性氧。继续加入10%甘油，厌氧条件下匀浆。分装于10 ml EP管中，-60 ℃冰箱保存［7]。第8天脓毒症模型制造，空白组取3 ml 0.9%氯化钠注射液经大鼠右下腹腹腔注射；脓毒症组、PA-脓毒症组取1.6 ml/kg粪便悬液，0.9%氯化钠注射液稀释至3 ml，经大鼠右下腹腹腔注射；严重脓毒症组、PA-严重脓毒症组取4 ml/kg粪便悬液，0.9%氯化钠注射液稀释至3 ml，经大鼠右下腹腹腔注射。

1.4测定指标

1.4.1成模标准表现为蜷缩、嗜睡、眼角出现分泌物、发热、寒颤、竖毛、全身乏力、运动活性降低、摄食减少［7，8]。血培养阳性为脓毒症成模标准。严重脓毒症成模标准为脓毒症标准合并至少一个组织或器官血流灌注不足或功能障碍。

1.4.2剖腹探查及标本采集建模成功后，用3%戊巴比妥钠注射液麻醉大鼠，固定于无菌操作台，颈部与腹部常规消毒、铺巾，分离右侧颈总动脉，留置动脉导管监测血压，行剖腹探查术，观察肠道大体形态，留取距离十二指肠球部远端10 cm处空肠组织约2 cm，生理盐水冲洗干净肠管内、外侧血液和粪便，置于无菌冻存管中，迅速保存于-60 ℃冰箱。另留取远端肠组织约2 cm，置于4%多聚甲醛溶液固定48 h，常规脱水、浸蜡、包埋、切片，HE染色后在光镜下观察组织病理形态变化。

1.5制备肠组织匀浆用无菌眼科剪取肠组织块（约0.2 g），在常温生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干。置于10 ml无菌EP管中，用眼科剪将组织剪碎。将液氮倒入EP管，将捣杆（玻璃棒）垂直插入EP管中，转动研磨数40次（5 min左右），充分研碎，使组织匀浆。加入提前配置好的蛋白裂解液，按照0.1 g组织加入1 ml蛋白裂解液的比例加入，制备待分离液，冰水浴2 h。冰水浴结束后，4 ℃离心机高速离心（12 000 r/min，20 min），取上清200 μl每管分装，保存于-60 ℃冰箱，待测。

1.6酶联免疫吸附剂测定将Rat ICAM-1 ELISA、Rat VCAM-1 ELISA试剂盒室温平衡20 min。铝箔袋中取出所需板条，设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品100 μl。样本孔先加待测样本50 μl，再加样本稀释液50 μl；空白孔不加。除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的检测抗体100 μl，用封板膜封住反应孔，28 ℃室温孵育1 h。之后弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。每孔加入底物A、B 各50 μl，37 ℃避光孵育15 min。每孔加入终止液50 μl，15 min 内，在450 nm 波长处测定各孔的OD值。绘制标准曲线，在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

1.7统计学处理应用SPSS 17.0统计软件分析，计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1大体观察注射粪便混悬液6 h左右，大鼠开始出现脓毒症症状，蜷缩、嗜睡、竖毛、摄食减少、对外界刺激运动活性降低。7 h经颈动脉抽血做血培养提示大肠埃希菌阳性。部分严重脓毒症大鼠出现点头样呼吸。解剖后，空白组肠管呈粉红色，血供良好；脓毒症组肠管色泽较暗，肠壁广泛充血、水肿，可见部分肠管积气；肉眼无法分辨脓毒症组和PA-脓毒症组大体标本区别；严重脓毒症组肠壁弥漫性充血水肿，肠管粘连，苍白；肉眼无法分辨严重脓毒症组和PA-严重脓毒症组大体标本区别。

2.2石蜡切片HE染色空白组肠上皮细胞完整，上皮和固有层连接紧密无缝隙，无炎性细胞浸润，肠腺体正常（图1A）。脓毒症组部分肠上皮细胞核固缩，固有层水肿，少量中性粒细胞浸润，固有层边缘少量毛细血管扩张、充血（图1B）。PA-脓毒症组可见小肠绒毛顶端上皮细胞脱落，嗜酸性粒细胞浸润（图1C）。严重脓毒症组部分切片可见小肠绒毛坏死，大部分细胞形态不存在，偶见单个中性粒细胞，固有层毛细血管充血，肠腺体形态存在（图1D）。PA-严重脓毒症组上皮细胞大量核固缩，固有层明显水肿，中性粒细胞及嗜酸性粒细胞浸润，毛细血管扩张、充血明显（图1E）。

图1　各组大鼠肠上皮细胞病理学改变（HE，×400）

2.3ICAM-1检测五组之间ICAM-1表达差异有统计学意义（F=33.337，P＜0.001）；进一步两两比较结果显示，脓毒症组（P=0.044）和严重脓毒症组（P＜0.001）ICAM-1表达与PA-脓毒症组比较，差异有统计学意义（图2）。

图2　大鼠肠组织ICAM-1表达水平

2.4VCAM-1检测五组之间VCAM-1表达差异有统计学意义（F=12.714，P＜0.001）；进一步两两比较结果显示，脓毒症组（P=0.044）、严重脓毒症组（P=0.262）VCAM-1表达与PA-脓毒症组比较差异无统计学意义（图3）。

图3　大鼠肠组织VCAM-1表达水平

3　讨　论

腹腔感染是指各种病原菌引起的腹腔内感染，通常为肠杆菌科细菌、肠球菌属和拟杆菌属等混合感染［9]。一旦发生腹腔感染，有可能导致短时间内大量细菌与毒素入血，引起SIRS，甚至MODS而危及生命，病死率高达24%［10]。笔者根据Gonnert人粪便悬液腹腔注射法制造大鼠脓毒症/严重脓毒症模型，既避免了传统盲肠结扎穿孔法（cecal ligation and puncture，CLP）方法造成的大鼠肠管壁直接破损对ICAM-1和VCAM-1表达的影响，又保留了大鼠肠道相对密闭性，在造模初期大鼠肠道黏膜屏障系统仍完整存在。当粪便混悬液注入大鼠腹腔后，局部发生炎性反应，释放入血的炎性介质使得毛细血管通透性增加，致病菌入血形成菌血症，进一步发展为SIRS。随着疾病加重，机体有效循环血量急剧减少，在交感-肾上腺髓质系统作用下全身血液重新分布，非重要器官例如胃肠道血管严重收缩。由于肠黏膜血流量急剧减少，黏膜缺血、水肿、血管通透性显著增加，肠黏膜糜烂甚至形成应激性溃疡，胃肠黏膜屏障功能遭到破坏。在上述病理生理状态下，外源性致病菌可进一步发生肠道定植，连同肠道内原本存在的细菌和大量内毒素突破肠黏膜屏障系统进入肝、脾、肺以及全身血液循环，引起大量炎性介质释放，导致肠源性脓毒症。本实验造模7 h后采血做血培养提示大肠埃希菌阳性，说明脓毒症模型制造成功，该模型稳定，脓毒症成模率达100%。

炎性反应发生时，在多种细胞因子作用下，ICAM-1在细胞表面表达迅速上调，与文献［11］相似。另有研究表明，肠道微血管内皮细胞ICAM-1及其在中性粒细胞上的配基CD11b/CD18表达上调，可介导中性粒细胞与局部血管内皮细胞粘附、相互作用、激活中性粒细胞，释放氧自由基和蛋白水解酶类，这是引起缺血和再灌注早期肠损伤的重要因素［12]。抑制ICAM-1表达，有助于降低胰腺炎肠黏膜血管内皮功能障碍的严重程度，降低局部IL-1表达和白细胞聚集浓度［13]。VCAM-1与ICAM-1结构相似，在哮喘患者的血清VCAM-1的水平升高，这可能与嗜酸性粒细胞的移行有关［14，15]。此外研究证实，阻断ICAM-1、VCAM-1的表达可减轻脑缺血炎性， 改善神经功能， 预防和治疗脑缺血损伤［16]。

在本实验中，与空白组相比，其余四组肠道ICAM-1 和VCAM-1表达水平均升高，这与前文所述多项研究结果一致。脓毒症发生时，大量炎性介质释放入血，通过上调ICAM-1、VCAM-1表达水平，促进炎性细胞向感染部位移行，发挥抗炎作用。另一方面，ICAM-1、VCAM-1表达增加，促使炎性细胞释放更多炎性介质，过量的炎性介质加剧缺血再灌注损伤，加重破坏肠黏膜屏障功能，导致更多致病菌和内毒素入血，形成恶性循环，加重脓毒症。石蜡切片染色，证明了上述推论。与空白组相比，其余四组小肠黏膜均有不同程度的炎性细胞弥漫，符合急性炎性反应和过敏性炎性的特点。

进一步比较，脓毒症组ICAM-1、VCAM-1表达水平均高于PA-脓毒症组，说明PA-MSHA预给药可抑制脓毒症大鼠肠道ICAM-1和VCAM-1的表达。这一调节机制可从以下三方面说明：（1）PA-MSHA可通过降低脓毒症大鼠血中促炎因子浓度（ TNF-α、IL-6等），从而降低促炎因子对ICAM-1和VCAM-1的直接活化作用，使ICAM-1和VCAM-1表达下调；（2）PA-MSHA能够减少TLR4受体在免疫细胞膜上的表达，通过抑制TLR4—NF-κB—促炎性因子通路，减少促炎因子TNF-α、IL-6等释放，从而有效抑制炎性级联反应，减轻了大鼠肠黏膜损伤；（3）PA-MSHA可通过增加抑炎因子IL-10产生和升高外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞比例，发挥抗感染作用的同时调节机体免疫功能，减轻炎性反应。这与近年多项研究结果一致，说明PA-MSHA可减轻LPS诱发的脓毒症的炎性反应［17，18]。

在严重脓毒症组的比较中，这一现象并不明显。严重脓毒症组ICAM-1表达水平低于PA-严重脓毒症组，而VCAM-1表达水平差异无统计学差异，说明PAMSHA对严重浓度症大鼠ICAM-1和VCAM-1的调节作用并不一致。进一步分析可能的原因，从病理结果可以看到，严重脓毒症大鼠肠黏膜发生了严重的缺血、水肿，肠黏膜上皮细胞和可能存在的炎性细胞大量坏死，坏死细胞释放出可使ICAM-1和VCAM-1失活的酶类。因此，此时测得的ICAM-1和VCAM-1受细胞坏死程度影响，并不能准确反映出PA-MSHA的作用。PAMSHA对严重脓毒症大鼠肠ICAM-1和VCAM-1的影响仍需进一步的研究。

综上所述，本研究证实了PA-MSHA预给药能降低轻症或早期脓毒症大鼠肠组织ICAM-1、VCAM-1表达水平，从而减轻肠道的炎性反应，减轻脓毒症。但是在严重脓毒症大鼠组中，这一作用并不明显。

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（2016-02-22 收稿2016-04-18 修回）

（责任编辑宋宫儒）

Effect of PA-MSHA on expression of ICAM-1 and VCAM-1 of intestinal tract in septic/severe septic rats

FANG Zheqi1，LI Xinyu2，WEI Yuying2，AN Zongren1，DUAN Yue1， and YU Yang1. 1. Department of Clinical Medicine， Medical College of Shihezi University，Xinjiang Uygur Autonomous Region， Shihezi 832002，China； 2. Department of Intensive Care Unit，Urumchi General Hospital of Xinjiang Military Command， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830000， China
Corresponding author：LI Xinyu，E-mail: lxy_icu@163.com

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of pre-administration of pseudomonas aeruginosa-mannose sensitive hemagglutinin （PA-MSHA） on the expression of intestinal intercellular cell adhesionmolecule-1 （ICAM-1） and vascular cell adhesion molecule 1 （VCAM-1）in septic/severe septic rats. Methods40 healthy SPF rats were randomly divided into five groups: blank group， the septic group and the severe septic group were given normal saline subcutaneous injection of 0.3 ml/day and PA-septic group and the PA-severe septic group were given PA-MSHA subcutaneous injection of 0.3 ml/d for 7 consecutive days. At the 8th day， five groups underwent intraperitoneal injection of the modified Gonnert human stool suspension to make septic/severe septic rat models. After monitoring vital signs， intestinal tissue from five groups was harvested and analyzed with HE staining and enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） to detect the expression of ICAM-1 and VCAM-1 in the intestinal tissue of rats. Results（1） HE staining showed that the morphological changes compared with blank group； （2）The average expression of ICAM-1 （F=33.337，P＜0.001） and VCAM-1 （F=12.714，P＜0.001） in intestinal tract shown statistically significant differences of five groups； （3） The expression of ICAM-1 was increased in septic group compared with PA-sepsis group （P＜0.05）， and severe septic group was increased PA-MSHA group （P＜0.05）. （3） The expression of VCAM-1 was increased in sepsis group compared with PA-sepsis group （P＜0.05）， and there was no significant difference in the expression of VCAM-1 between the severe septic group and PA-severe sepsis group （P=0.262）. Conclusions（1） The expression of ICAM-1 and VCAM-1 in intestinal tract in septic/severe septic rats was increased. （2） PA-MSHA pretreatment can inhibit the expression of ICAM-1 and VCAM-1 in intestinal tract in septic group. （3） In severe septic rats， the level of ICAM-1 and VCAM-1 can not accurately reflect the effect of PA-MSHA. The reason may be related to necrosis ofintestinal epithelial cells and inflammatory cells.

【Key words】sepsis； pseudomonas aeruginosa-mannose sensitive hemagglutinin； intercellular cell adhesionmolecule-1； vascular cell adhesion molecule-1

【中国图书分类号】R631

DOI：10.13919/j.issn.2095-6274.2016.05.003

基金项目：全军十二五课题（CWS11J236）

作者简介：方喆琦，硕士研究生在读，医师，

通讯作者：李新宇，E-mail：lxy_icu@163.com