斑腿泛树蛙(Rhacophorus megacephalus)雄性年龄及其睾丸的不对称

陈　成，娄尚灵，米志平，曾　燏，廖文波

(西华师范大学a.生命科学学院;b.珍稀动植物研究所, 四川 南充　637009)

斑腿泛树蛙(Rhacophorus megacephalus)雄性年龄及其睾丸的不对称

陈成a，娄尚灵b，米志平b，曾燏b，廖文波a

(西华师范大学a.生命科学学院;b.珍稀动植物研究所, 四川 南充637009)

摘要：在脊椎动物中睾丸的大小不对称是常见现象，这一现象通常可以用补偿假说来解释。该假说认为两个睾丸中较小的一个的增大是为了补偿较大一个睾丸在功能上的不足，并且方向不对称的程度与雄性质量成正相关关系。对重庆市缙云山自然保护区的斑腿泛树蛙(Rhacophorus megacephalus)雄性的年龄和睾丸不对称性进行了研究。结果发现该种群的雄性成体平均年龄为2.91 ± 0.83 岁，性成熟年龄为2岁，最大寿命为5岁，并且体长和体重都随年龄的增加而增加。该种群雄性的左右睾丸大小没有差别，左睾丸减右睾丸的差值服从正态分布，表明该物种的睾丸大小不对称性属于波动不对称；左右睾丸重与相对睾丸不对称程度都没有相关性，说明左右睾丸均不充当补偿角色；绝对睾丸不对称程度同个体体长、年龄、身体状况以及精子密度都没有相关性；相对睾丸不对称程度与个体体长、年龄和身体状况也没有相关性，与精子密度显著负相关。本研究发现在这个斑腿树蛙自然种群中没有关于补偿假说的证据。此外，还发现拥有相对较大的右睾丸的个体相对于拥有较大左睾丸的个体，其精子密度更大。

关键词：斑腿泛树蛙；年龄；睾丸大小；睾丸不对称；补偿假说；精子密度

1引言

生物体同种器官的形态在身体左右两侧的对称性分为三种类型：方向不对称(左右两侧的形态指标之间的差值偏离原点且差值服从正态分布)、反向不对称(左右两侧的形态指标之间的差值不服从正态分布)和波动不对称(左右两侧的形态指标之间的差值不偏离原点且差值服从正态分布)[1-3]。正如动物很多其它器官的不对称一样，睾丸的不对称性也得到了广泛的研究[4-7],这些研究中主要包括了方向不对称[8,9]和波动不对称[10-12]。对于睾丸的这两种不对称形式，目前通常用补偿假说来解释。该假说认为：(1)当较大睾丸功能异常或功能不足时较小睾丸才起补偿的作用，也就是说相对睾丸不对称性与较大睾丸的大小成正相关关系；(2)睾丸不对称程度越大可能反应出雄性在某些特征上的特点越明显[3,13]。然而，自从该假说提出过后符合补偿假说的研究[14-16]和不符合补偿假说的研究[17]都有报道。

雄性质量可以从多方面得到反映。身体状况就通常用于评估雄性质量[18-24]。对于两栖类的无尾目，年龄和身体大小有时也可以反应雄性质量的好坏[25]。在体外授精的物种中，精子的密度直接反映了该物种在繁殖时雄性的繁殖成功率，而且精子密度往往与雄性质量直接相关[26，27]。

斑腿泛树蛙(Rhacophorus megacephalus) 在中国是一个广泛分布的物种。它的繁殖高峰期一般在四月到六月，常栖息于稻田、水边的灌木丛和草丛中。该物种一般分布在海拔520m到2 200m之间[28]。到目前为止，还没有关于斑腿泛树蛙年龄和睾丸方面的研究报道。在本研究中我们研究了重庆缙云山自然保护区斑腿泛树蛙雄性的年龄和睾丸的不对称情况。我们的研究目的包括三个：(1)研究这个斑腿泛树蛙自然种群雄性的年龄结构；(2)研究该种群的睾丸不对称性是否是方向不对称；(3)验证Møller的补偿假说是否适用于该斑腿泛树蛙种群。

2材料和方法

2011年和2013年的7月5日到7月12日期间我们分别从重庆市缙云山自然保护区(29°50.40′N, 106°22.86′E, 688m)采集了17只雄性和30只雄性斑腿泛树蛙。所有的个体都是在手电筒的照射下直接用手捕捉，采集于稻田和草丛。通过观察婚垫来鉴别是否为成体然后将其带回实验室。所有用于本研究的蛙均得到西华师范大学的许可。

所有个体带回实验室后均用精度为0.01mm的游标卡尺测量每个个体的体长(吻端到泄殖孔)，并且采用精度为0.1mg的电子天平测量每个个体的体重。然后采用双毁髓法处死每个个体并解剖。完整地取出左右睾丸后，同样采用精度为0.1mg的电子天平分别测量其重量，并分别记录每个个体左右睾丸的重量。

我们对2013年采集的30个雄性个体的精子数量进行了测量。首先称量一个干净空的30mL培养皿记为M1，然后将睾丸和5mL蒸馏水倒入此培养皿并用镊子将其完全捣碎，用蒸馏水将镊子上的残留物全部冲入培养皿，然后在同一电子天平称量并记为M2。将混合液混匀后用250μL的移液管将其注入血细胞计数板上(XB-K-25)并放置于荧光显微镜(OlympusBH-2)下，使用计数器数出0.1μL混合液中的精子数，其数量计为A。每个个体的精子总数采用公式：精子数量=A×(M2-M1)×104来计算。

个体年龄的确定采用骨龄学方法[29]，该方法已经被广泛应用于无尾目中[30-36]。我们首先去掉每个趾骨的皮肤和肌肉组织，并将骨头浸入5%的生理硝酸溶液中脱钙，然后用苏木精对其进行染色。最后再依次脱水、透明、浸蜡、包埋之后，放置于切片机上将其横切为13μm厚的切片，挑选骨髓腔最小的部位的切片在载玻片上展片后使用显微镜确定每个个体的年龄。第一龄的年龄线通过观察Kastschenko线(KL，骨内外膜的分界线，图 1)来确定[37]。

左右睾丸大小的差别采用配对t检验进行检测，并且采用Shapiro-Wilks检验检测左睾丸与右睾丸的差值是否符合正态分布。我们将体长作为自变量，体重作为因变量进行线性拟合，用回归分析的残差值作为身体状况指数。使用个体的精子数量除以左右睾丸的总重量计算每个个体的精子密度。左右睾丸的不对称程度采用绝对不对称(左睾丸-右睾丸)和相对不对称((左睾丸-右睾丸) /0.5(左睾丸+右睾丸))两种方式计算。

为了确定该斑腿泛树蛙种群的睾丸不对称性是否可以通过补偿假说来进行解释，我们分析了相对睾丸不对称性和左右睾丸重的Pearson相关性，并且采用偏相关分析分别检测绝对睾丸不对称和相对睾丸不对称同体长、年龄、身体状况以及精子密度之间的相关性。所有的数据分析均采用统计软件SPSS17.0进行统计分析。统计数据检测采用双尾检测，显著水平设置为α=0.05。

3结果

在本研究中很少发现骨内膜被吸收，假线和双重线也很好辨别(图1)，因此并不影响我们鉴别年龄。雄性的平均体长和平均体重分别是44.20±3.10mm和5.13±0.9g。该种群的成体平均年龄为2.91±0.83 岁，范围在2岁到5岁之间(图2)。体重随年龄的增加而增加(图3a,r=0.445,n=47,P=0.002)，体长也随年龄的增加而增加(图3b,r=0.378,n=47,P=0.009)。

左右睾丸比较发现该种群个体的左睾丸和右睾丸之间无显著差别(t=0.677,df=46,P=0.502)。左右睾丸重量的差值为0.7 ± 1.0mg，平均值与零的差异不显著(P=0.502)且符合正态分布(图 4，df=47,偏度= -0.021±0.347，峰度=0.637±0.681，P=0.482)，表明该斑腿泛树蛙种群的睾丸不对称属于波动不对称。

通过Pearson相关性分析发现相对睾丸重和左右睾丸都没有相关性(左睾丸：r=0.255,n= 47,P=0.083；右睾丸：r=-0.215,n= 47,P=0.146)。并且通过偏相关分析发现绝对睾丸不对称性和体长(r=0.026,df=25,P=0.897)、年龄(r=-0.098,df=25,P=0.627)、身体状况(r=-0.091,df=25,P=0.652)以及精子密度(r=-0.233,df=25,P=0.243)都没有相关性，相对睾丸不对称性和体长(r=0.089,df=25,P=0.659)、年龄(r=-0.165,df=25,P=0.410)以及身体状况(r=-0.174,df=25,P=0.386)都没有相关性。我们甚至发现相对睾丸不对称性和精子密度有显著的负相关关系(r=-0.409,df=25,P=0.034)。因此，我们没有找到关于补偿假说的相关证据。但我们发现右睾丸较大的个体比左睾丸较大的个体精子密度高(t=2.258,P=0.038)。

表1　睾丸不对称程度同雄性各特征间的相关系数和P值

注：计算某个特征变量与不对称程度间的相关系数和p值时，其他三个特征变量作为协变量，所有分析的自由度(df)都为25。

4讨论

如图1所示，骨龄学方法非常适合用于确定斑腿泛树蛙的年龄。在两栖动物中，成体体长和年龄的关系在不同种群中是不同的[38-41]。一些种群中个体体长和年龄成正相关关系[42,43]，但是一些种群并不表现出这种关系[44,45]。在本研究中，我们发现该斑腿泛树蛙种群雄性个体的体长和年龄是显著正相关的，说明该种群的雄性个体是终生生长的。

很多研究发现鸟类[3-6，13]和无尾类[25，46，47]左睾丸大于右睾丸，也有少量的研究发现了相反的情况(右>左)[48,49]。我们的研究结果表明，斑腿泛树蛙的左右睾丸没有差异，成波动不对称性。相似的结果目前在无尾类中仅发现于峨眉树蛙(Rhacophorusomeimontis)种群中[12]。对于很多种群来说，波动不对称的结构是种群对环境压力的一种适应特征[50-53]，同时也是个体发育的不稳定性的一种体现[54-57]。有实验研究已经验证了波动不对称可以用于监测脊椎动物的选择压力大小[58,59]。这些不对称形式通常与同性间的竞争有关[60]。因为斑腿泛树蛙的婚配模式是一雌多雄[28,61]，睾丸的波动不对称可能是雄性之间激烈的竞争压力的反映。

一些研究发现睾丸的不对称程度与体现雄性质量的特征参数正相关。在一些物种中体重越大睾丸越不对称[49]，还有一些鸟类的个体年龄越大睾丸越不对称[8,9],这些符合补偿假说的类型可以解释为维持两个较大睾丸所付出的代价高于维持一个较大睾丸而将另一个较小睾丸用于补偿作用的情况[13,15]。但是在本研究中我们未发现相对睾丸不对称性和任何一侧的睾丸重有相关性。并且我们也没有发现睾丸的不对称程度同体现雄性质量的特征参数(体长、年龄、身体状况、精子密度)之间有正相关关系。同样的结果在其它物种中也有发现，例如有身体状况不能反映左右睾丸的不对称程度的鸟类[8,62]，黑斑蛙和沼水蛙的身体状况和年龄都与睾丸的不对称程度无相关性[46,47]。我们的结果表明该斑腿泛树蛙种群的睾丸不对性不符合补偿假说，这种现象同鲫鱼相似[63]。

有研究用空间限制假说来解释相同器官在身体两侧的不对称性，该假说认为由于体腔大小限制身体两侧的器官往往会选择不对称发育从而充分的利用有限的空间。根据该假说睾丸的发育就应该是方向性不对称[64]，但是该假说似乎也不能用于解释斑腿泛树蛙睾丸的波动不对称。Yu(1998)推测睾丸的不对称可能是每个个体两侧给睾丸提供营养物质和能量的血管发育不同，从而导致营养和能量在左右睾丸的分配不同[7]。这个解释可以解释睾丸的波动不对称，将来的研究需要考虑睾丸和与它们相连的血管之间的关系。

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TesticularAsymmetryinSpot-leggedTreefrog(Rhacophorus megacephalus)

CHENChenga,LOUShanglingb,MiZhipingb,ZENGYub,LIAOWenboa

(a.CollegeofLifeSciences,b.InstituteofRareAnimalandPlant,ChinaWestNormalUniversity,NanchongSichuan,637009,China)

Abstract:Testicular asymmetry in vertebrates is common and usually can be explained by compensation hypothesis which states that the smaller of the two testes increases in size to compensate the defection of the larger one,and thus the degree of directional asymmetry will positively correlate with male quality.In this study, we studied the age and testicular asymmetry in the Spot-legged Treefrog (Rhacophorus megacephalus) on Jinyun Mountain Nature Reserve.Mean adult age of this population was 2.89 ± 0.83, and the sexual maturity age and longevity were 2 and 5 years old respectively.Body size and body mass were both increased with age.We found that there was no difference between left and right testis and the distribution of left-minus-right mass conformed to normal distribution with a mean value not deviating from zero,suggesting a fluctuating asymmetry in testes in R.megacephalus.Our findings suggested that neither of the two testes correlated with relative testicular asymmetry indicating that neither of the two testes served as compensatory role.There were no correlations between the absolute testicular asymmetry and body size,age,body condition,or sperm density.And relative testicular asymmetry was also not correlated to body size,age or body condition,but it negatively correlated with sperm density.So no evidence conformed to compensation theory was found in this natural population. Moreover,we found that those individuals with larger right testis had larger sperm density than those with larger left testis.

Keywords：Rhacophorus megacephalus;age;testis size;testicular asymmetry;compensation hypothesis;sperm density

文章编号：1673-5072(2016)02-0137-07

收稿日期：2015-6-15

基金项目：四川省杰出青年科学基金项目(JQ20130016)。

作者简介：陈成，(1988—)，男，四川巴中人，硕士研究生，主要从事两栖类动物研究。 通讯作者：廖文波，(1979—)，男，四川遂宁人，教授，主要从事两栖类动物研究。E-mail：Liaobo_0_0@126.com

中图分类号：Q954.3

文献标识码：A

DOI：10.16246/j.issn.1673-5072.2016.02.003