siRNAs对ACVR1基因的沉默效果

左 跃, 张克勤

(1. 同济大学医学院，上海 200092； 2. 同济大学附属同济医院内分泌科，上海 200065)



·基础研究·

siRNAs对ACVR1基因的沉默效果

左 跃1, 张克勤2

(1. 同济大学医学院，上海 200092； 2. 同济大学附属同济医院内分泌科，上海 200065)

目的 比较五种不同的siRNA对进行性骨化性纤维增殖不良症模型细胞中ACVR1基因的抑制效果。方法 实验组分为A、B、C、D、E五组，分别转染五种不同序列的siRNA，对照组转染通用阴性siRNA和试剂。转染36h后，采用实时荧光定量PCR检验各实验组对ACVR1基因的抑制率。结果 与试剂对照组相比，只有E组观察到了25.5%的抑制率(P>0.05)，其余各组未观察到抑制效果。结论 可以排除四种siRNA序列对ACVR1基因不具有抑制作用。转染正义链序列为5′-CCAGGUGGAUUGUUUCGAU-3′的siRNA对ACVR1基因可能有抑制作用。

进行性骨化性纤维增殖不良症； 小干扰RNA； ACVR1基因

进行性骨化性纤维增殖不良症(fibrodysplasia ossificans progressiva, FOP)是一种罕见的严重致残性骨病，其病因是由于ACVR1基因发生杂合性激活性点突变c.617G>A (R206H)，导致骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)信号通路增强[1]。BMP信号通路是体内很多器官和组织发挥功能所必须的。目前，大部分治疗FOP的药物会阻断全部BMP信号通路，因此带来很大的副作用[2]。仅仅阻断突变型ACVR1(Mutant, M)而不影响正常的ACVR1受体下游信号转导成为治疗FOP的理想方法。为了对比只针对突变基因特异性的小干扰RNA(allele-specific small interfering RNA, ASP-siRNA)[3]和针对全部ACVR1基因(包括突变型和野生型)的小干扰RNA(non-allele-specific small interfering RNA, NASP-siRNA)对FOP模型细胞的ACVR1基因的抑制效果，本实验在Medici等[4]建立的FOP模型细胞基础上，转染两种ASP-siRNA和三种NASP-siRNA，通过RT-qRCR比较这些siRNA对ACVR1基因的干扰沉默效果。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和器材

人脐静脉内皮细胞(HUVEC)购自美国模式培养物集存库；携带有ACVR1R206H基因绿色荧光蛋白标记(GFP)的腺病毒[Ad-ACVR1(M)-IRES-GFP]购自英潍捷基公司；内皮细胞培养基购自Lonza公司；胎牛血清、青链霉素、内皮细胞无血清培养基、成骨诱导培养基、Opti-MEM培养基、转染试剂LipofectamineTM2000等购自Gibco公司；RNAiso Plus、无RNA酶的水、反转录试剂盒、RT-qPCR试剂盒(SYB Green法)购自TaKaRa公司；2×Taq PCR Master Mix购自上海莱枫生物科技有限公司；细胞培养皿和6孔板购自美国Corning公司；RT-qPCR仪为Roche Lightcycler 1.5。siRNA和通用的siRNA阴性对照由上海拓然生物科技有限公司化学合成，均在正义链的5′端加上胆固醇基团修饰。其中，两种ASP-siRNA序列引自Kaplan等[3]。ACVR1引物、GAPDH引物由生物工程(上海)有限公司设计合成。

1.2 分组

实验组分为转入ASP-siRNA的A、B组，转入NASP-siRNA的C、D、E组，对照组为转入通用siRNA的阴性对照组(NC组)及未转入siRNA的试剂对照组(Mock组)，试剂对照组除了不含siRNA，其余步骤相同。各个实验组转入的siRNA序列见表1。

表1 各实验组转入siRNA的序列

1.3 方法

1.3.1 细胞模型构建和siRNA转染 细胞培养方法参考文献[4]： 将HUVEC复苏于含10%胎牛血清和1%青链霉素的内皮细胞培养基中，置于 37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中。待培养皿中细胞融合80%以上后，接种于6孔板中。转染携带有ACVR1R206H基因绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)标记的腺病毒[Ad-ACVR1(M)-IRES-GFP]后在内皮细胞转变为干细胞样时开始成骨诱导[4]。细胞成骨诱导3d后，细胞密度在50%左右，开始转染siRNA： 先给6孔板换液，每孔含未添加血清和抗生素的成骨诱导培养基 1.5ml；用250μl 不含血清的Opti-MEM培养基稀释5μl siRNA储存液(20μmol/L)，轻轻混匀，室温孵育5min；用250μl不含血清的Opti-MEM培养基稀释3μl LipofectamineTM2000，轻轻混匀，室温孵育5min；将上述稀释后的siRNA和稀释后的Lipofectamine2000轻轻混匀，室温孵育 20min 后，加入含有细胞的1.5ml培养基的培养孔中，轻轻混匀，siRNA终浓度为50nmol/L。

1.3.2 提取总RNA和RT-qPCR 转染结束36h后，使用RNAiso PLus、氯仿(三氯甲烷)、异丙醇、乙醇、无RNA酶的水等试剂提取各组细胞总RNA；按照反转录试剂盒说明书反转录为cDNA，条件为37℃ 15min，85℃ 5s。ACVR1引物： 扩增包括突变型和野生型的全部ACVR1基因，正义： 5′-GAA-GGTCTCTCCTGCGGTAA-3′，反义： 5′-AGG-TCATCTTTCCCTGCTCA-3′，扩增产物为 130bp 片段。根据RT-qPCR试剂盒(SYB Green法)使用说明，使用上述ACVR1引物对目的基因进行扩增，以GAPDH为内参。1阶段： 95℃ 30s；2阶段： 95℃ 5s，60℃ 20s，40 个循环；3阶段： 95℃ 0s，65℃ 15s，95℃ 0s。实验重复3次。采用2-△△CT方法分析结果[5]： 每一样品的目的基因CT值减去该样品相应的内参GAPDH的CT值即为△CT，以2-△CT表示该样品的目的基因mRNA相对表达量。转染了siRNA组的基因抑制率=(1-2-△△CT)×100%，其中-△△CT=-(该组的△CT-Mock组△CT)。

每组的cDNA分别经普通PCR扩增，体系配制和反应条件按照2×Taq PCR Master Mix说明书，扩增产物用含0.1μg/ml GoldView的2%琼脂糖凝胶在1×TAE电泳缓冲液中电泳200V 25min，电泳后紫外灯下观察是否有扩增成功的ACVR1目的基因条带和GAPDH条带，以及有无杂带并拍照记录。

1.4 统计学处理

统计分析软件为SPSS 21.0，组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组cDNA普通PCR扩增产物电泳

图1中可见ACVR1目的基因条带和内参GAPDH条带，无其他非特异性条带，表明总RNA提取和反转录为cDNA成功，引物设计符合要求，无非特异性产物。

图1 各组cDNA经普通PCR扩增产物电泳图Fig.1 Electrophoretogram of PCR products of cDNA in each groupA： 目的基因ACVR1；B： 内参基因GAPDH

2.2 RT-qPCR结果

所有的扩增曲线正常，溶解曲线呈单峰，表明没有非特异性产物。与试剂对照Mock组比较，A组目的基因表达量增加了2.336倍(P<0.05)，B组目的基因表达量增加了1.588倍(P<0.05)，C组目的基因表达量增加了0.202倍(P>0.05)，D组目的基因表达量增加了0.894倍(P>0.05)，E组目的基因表达量下降了25.5%，即抑制率为25.5%(P>0.05)，NC组目的基因表达量增加了2.904倍(P<0.05)。实验组中的A、B、C、D组和NC组对FOP模型细胞的ACVR1基因没有抑制作用，实验组中的E组对FOP模型细胞的ACVR1基因的抑制率为25.5%，差异无统计学意义。

3 讨 论

FOP又叫骨化性肌炎，俗称“木头人”，是一种罕见的严重致残性骨病，其特点为先天性大脚趾畸形和进行性异位成骨[1]。临床表现为创伤、肌肉拉伸、肌肉注射等诱发或自发的软组织肿胀疼痛，逐渐在软组织内异位成骨，如果发生在关节处则可以引起关节僵硬和活动受限[1]，有的患者甚至双膝关节受累，导致双腿固定而无法行走。典型的FOP病因是由于ACVR1基因发生杂合性激活性点突变(c.617G>A)，该基因编码的膜受体ACVR1/ALK2蛋白属于BMP Ⅰ型受体基因突变发生在ACVR1/ALK2蛋白GS区域，下游BMP信号通路增强[6]。目前，该病没有明确的治疗手段，重在预防和避免摔倒、外伤、感染，肌肉注射等可能加重病情或导致异位成骨的因素[1]。所以，研发新的有效药物迫在眉睫。

ACVR1受体的下游BMP信号通路不仅仅是ACVR1也是很多其他膜受体的共同下游信号通路，是大部分组织细胞的正常功能所必须的，如果阻断全部BMP信号通路，则有可能会带来很大的副作用[2]。所以，单纯阻断突变的ACVR1(M)受体或者其相应的突变型mRNA(M)理论上应该副作用最小。因此，只针对突变型mRNA(M)设计、与包含突变位点在内的一段cDNA序列同源的siRNA理论上应该具有等位基因特异性，有可能成为一种理想的治疗手段。目前国内外对于FOP的治疗学研究中很少有关于siRNA方面的报道，其中Kaplan等[3]和Takahashi等[7]已经成功使用等位基因特异性的ASP-RNAi，使突变型的ACVR1 mRNA降解，选择性地抑制ACVR1(M)功能。

siRNA是一种长度为21～28个核糖核苷酸构成的RNA双链，其与细胞中的诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)结合后，可以靶向切割与siRNA正义链序列完全相同的同源性mRNA从而导致其降解，在mRNA水平上使靶基因沉默[8]。但是不是所有针对靶基因设计的siRNA都具有干扰效果，实验验证是必要的。因此在本实验中，通过RT-qPCR实验验证了两种ASP-siRNA和三种NASP-siRNA对ACVR1基因是否具有抑制效果，此外，siRNA化学合成法简便易行，且在siRNA正义链的5′端加上胆固醇基团修饰，可以增加siRNA的稳定性，促进其进入细胞[9]，可以减少转染试剂的使用量和细胞毒性。

在本实验中，转染了ASP-siRNA的A组和B组都没有表现出抑制效果，提示需要考虑重新设计针对ACVR1(M)等位基因特异性的siRNA；转染了NASP-siRNA的实验组中，C组和D组都没有表现出抑制效果；上述各实验组中转染的siRNA序列都可以排除对ACVR1基因的抑制作用。E组所转染的正义链序列为5′-CCAGGUGGAUUGUUUCG-AU-3′的NASP-siRNA对ACVR1目的基因的沉默抑制率为25.5%，虽然差异经检验没有统计学意义(P>0.05)，有可能是因为样本量太小(n=3)，统计学检验效能太低，没有得出有差异的结论，不过可以为以后的实验提供可靠的参考。在后面的实验研究中，可以从扩大样本量，提高转染siRNA的终浓度，延长从转染到提取总RNA的时间，以及应用更加准确的RT-qPCR数据分析方法等方面改进，有可能需要重新设计效果更好的ASP-siRNA。此外，本研究只探讨了siRNA对总的ACVR1基因的抑制效果比较，siRNA对FOP细胞模型ACVR1基因的野生型和突变型的抑制分别为多少以及下游信号通路的变化还有待于进一步实验观察。而且，将siRNA应用于人体内治疗还需要考虑增加siRNA在体内的稳定性而不降低其干扰活性，提高靶向性及应用合适的体内递送载体等[10]。

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[5] 潘沛江，叶力，陈晖，等.siRNA对人-单核巨噬细胞TLR2基因表达的抑制[J].中国免疫学杂志，2014，3(8)： 1032-1035.

[6] Pignolo RJ, Shore EM, Kaplan FS. Fibrodysplasia ossificans progressiva： diagnosis, management, and therapeutic horizons[J]. Pediatr Endocrinol Rev，2013, 10(Suppl 2)： 437-448.

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Effects of siRNAs on ACVR1 gene

ZUOYue1,ZHANGKe-qin2

(1． Medical College，Tongji University, Shanghai 200092, China；2. Dept. of Endocrinology, Tongji Hospital，Tongji University, Shanghai 200065, China)

Objective To compare the effects of five different siRNAs on ACVR1 gene in fibrodysplasia ossificans progressiva (FOP) cells. Methods Five different siRNAs were trensfected into cultured FOP cells (groups A, B, C, D, E), non-trensfected FOP cells (negative control) and mock-transfected cells (mock transfection control) were used as controls. Real-time fluorescence quantitative PCR (RT-qPCR) was performed at 36h after transfection. Results Only a 25.5% suppression of ACVR1 was observed in group E (P>0.05). Conclusion siRNA with sense strand 5′-CCAGGUGGAUUGUUUCGAU-3′ may suppress the ACVR1 gene, while other 4 studied seque-nces are not effective.

fibrodysplasia ossificans progressiva； small interfering RNA； ACVR1 gene

10.16118/j.1008-0392.2016.01.007

2015-09-04

国家自然科学基金(81170802)

左 跃(1989—)，女，硕士研究生.E-mail： zuoyue1989@163.com

张克勤.E-mail： keqzhang2007@126.com

R 392.2

A

1008-0392(2016)01-0033-04