8种常见芽菜致病微生物的分离鉴定

张安华蔡　翔陈　涛王　萍祝菊红赵志远

（1武汉市农业科学技术研究院作物科学研究所，湖北武汉 430345；2武汉维尔福生物科技股份有限公司，湖北武汉 430345；3湖北维民种苗有限公司，湖北武汉 430207）



8种常见芽菜致病微生物的分离鉴定

张安华1蔡翔2陈涛3王萍1祝菊红1赵志远1

（1武汉市农业科学技术研究院作物科学研究所，湖北武汉 430345；2武汉维尔福生物科技股份有限公司，湖北武汉 430345；3湖北维民种苗有限公司，湖北武汉 430207）

摘 要：对目前产业化程度较高的黄豆、黑豆、豇豆、萝卜、蕹菜、花生、黄秋葵、向日葵等8种芽菜患病植株上的致病微生物进行分离、纯化，共得到24株细菌菌株和8株真菌菌株；利用真菌ITS和细菌16S rDNA通用引物，分别对分离得到的细菌和真菌基因组进行分子生物学鉴定。结果表明：24株细菌分属8个属，分别为克雷伯氏菌属（Klebsiella）、肠杆菌属（Enterobacter）、假单胞菌属（Pseudomonas）、不动杆菌属（Acinetobacter）、果胶杆菌属（Pectobacterium）、短稳杆菌属（Empedobacter）、戴尔福特菌属（Delftia）、从毛单孢菌属（Comamonas）；24株细菌均为革兰氏阴性菌，除果胶杆菌属外，其余都不是典型的植物病原菌；其中不动杆菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属和假单胞菌属的细菌出现在2种或2种以上芽菜上；另外4个属的细菌则只出现在1种芽菜上，呈现出寄主的专化性。8株真菌分属3个属，分别为镰刀菌属（Fusarium）、链格孢属（Alternaria）和根霉属（Rhizopus）；其中根霉属和链格孢属的真菌分别只出现在萝卜芽菜和蕹菜芽菜上，其他6种芽菜上分离得到的真菌菌株均属于镰刀菌属。分离菌株回接试验结果表明，所有菌株均能对芽菜造成不同程度的腐烂症状，生产过程中环境微生物污染同样能致芽菜腐烂病发生。

关键词：芽菜；致病微生物；真菌；细菌；分离鉴定

张安华，男，高级农艺师，专业方向：作物栽培，E-mail：1259157360@qq.com

芽菜是利用农业学上的种子在特定环境条件下培育出的可供食用的芽苗类蔬菜的总称，具有适用品种多、生长周期短、单位产值高、易于工厂化生产等产品特性，以其安全、营养、保健等特点走入百姓餐桌（康玉凡 等，2008）。据统计，目前国内市场上常见的芽苗菜种类达30种之多（袁星星等，2014）。工厂化生产过程中，芽菜腐烂问题一直困扰着生产企业，每年因芽菜腐烂造成的损失可达10%（李振华 等，2011；袁星星 等，2014）。张丽等（2010，2011）对国内多家工厂化生产的芽菜进行取样、鉴定，发现豆类芽菜生产中的主要真菌病害是瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum）以及立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）引起的腐烂病。生产实践中，不同种类和品种的芽菜感病症状和程度不尽一致，且表现出极强的季节差异。目前，国内针对芽菜烂种、烂芽的研究多集中于种子带菌的防控，而忽视了生产过程中的环境微生物污染。

本试验以目前产业化程度较高的黄豆、黑豆、豇豆、萝卜、蕹菜（空心菜）、花生、黄秋葵和向日葵等8种芽菜为试验材料，对患病植株上的微生物进行采集、分离和菌株纯化，采用分子生物学与形态学相结合的方法对微生物进行鉴定，确定病原微生物类型与致病性，旨在为科学高效防治芽菜腐烂病提供理论参考。

1　材料与方法

1.1样品采集、分离及菌株纯化

2014年3～6月，分别从湖北玉如意芽业集团和湖北维民种苗公司生产车间选取黄豆、萝卜、蕹菜、花生、豇豆、黑豆、黄秋葵和向日葵等8种芽菜中有腐烂症状的患病植株，每种芽菜取15～25株，共取样180株。

采用常规组织分离法进行病原物分离。培养过程中，若长出真菌则直接将其转接至PDA平板上，培养5 d后挑取菌落边缘菌丝块接种至新的PDA平板上进行培养，重复进行3次，得到纯化的真菌；若长出细菌则采用接种环在NA平板上划线，培养24 h后挑取单菌落在NA平板上进行培养，重复进行3次，得到纯化的细菌（方中达，1996）。

1.2病原微生物形态学鉴定

将纯化的细菌菌株置于NA平板上，真菌菌株置于PDA平板上，在25 ℃条件下进行培养，细菌培养24 h；真菌培养5～10 d。观察、记载菌落培养性状，根据菌落形态及显微镜下菌丝、孢子形态等特征进行鉴定。

1.3病原微生物分子生物学鉴定

1.3.1病原细菌分子生物学鉴定 用牙签挑取1个单菌落放入2 mL NA液体培养基中，置于25 ℃下摇培24 h。然后采用细菌通用引物27F （5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R （5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）直接对分离细菌菌体进行16S rDNA基因片段的扩增。PCR扩增反应体系：10×PCR Buffer（10 mmol·L-1）5.0 μL，dNTP Mixture（10 mmol·L-1）1.0 μL，TaKaRa Taq酶（5 U·μL-1）0.5 μL，引物1（20 μmol·L-1）1.0 μL，引物2（20 μmol·L-1）1.0 μL，菌液（浓度约为1×109cfu·mL-1）1.0 μL，ddH2O 40.5 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30个循环；72 ℃延伸5 min（Innis et al.，1990）。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后送武汉擎科创新生物有限公司测序。

1.3.2病原真菌分子生物学鉴定 将分离出的真菌接种在铺有玻璃纸的PDA培养基上，25 ℃培养3～5 d，从培养基上刮取0.2 g新鲜菌丝置于研钵中，采用CTAB法（Innis et al.，1990）进行DNA提取，然后将DNA浓度稀释为50 ng· μL-1，于-20 ℃下保存备用。采用ITS通用引物ITS1 （5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4 （5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）进行PCR扩增。PCR扩增体系与1.3.1细菌鉴定所采用的相同。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s，59℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸5 min（Innis et al.，1990）。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后送武汉擎科创新生物有限公司测序。

1.4序列分析

测序结果利用DNAman软件进行格式化，选择2条引物（包含引物）之间的序列，通过BLAST （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）程序与GenBank核酸数据库进行比对。

1.5分离菌株回接试验

选取生产实践中发病较严重且表面分离到的微生物种类较多的萝卜和蕹菜进行细菌回接试验，采用黑豆进行真菌回接试验。供试萝卜品种为短叶十三，蕹菜品种为超白梗，黑豆品种为黑豆2号，种子千粒重分别为14.42、43.92、340.00 g，均由湖北玉如意芽业集团提供。

根据分子生物学鉴定结果，选取分属于3个属的真菌HQK-1、KXC-1、LB-1进行培养，用血球计数板配制成含孢子1×106个·mL-1的孢子悬浮液。选取分属于4个属的细菌KXC-A、KXC-B、LB-A、LB-B进行培养，用平板菌落计数法配制成浓度为1×108cfu·mL-1的悬浮液。

选择外观整齐、籽粒饱满的萝卜种子、蕹菜种子和黑豆种子各100粒，用2%次氯酸钠溶液浸泡2 min，然后用自来水冲洗3次，自然风干，分别用真菌孢子悬浮液或者细菌菌液浸泡4 h，以无菌水浸泡的种子作为对照，按照一般生产流程生产芽菜，观察病害发生情况。每处理2次重复。

2　结果与分析

2.1微生物的分离

从8种芽菜患病植株上共分离得到24株优势细菌菌株、8株优势真菌菌株。分别为蕹菜：4 株细菌、1 株真菌；黄豆：2 株细菌、1 株真菌；黄秋葵：3 株细菌、1 株真菌；豇豆：2 株细菌、1 株真菌；花生：3 株细菌、1 株真菌；向日葵：4 株细菌、1 株真菌；萝卜：3 株细菌、1 株真菌；黑豆：3 株细菌、1 株真菌。

2.2病原微生物形态学鉴定结果

本试验分离所得细菌均为白色或浅黄色，菌落边缘平滑，培养24 h后菌落具流动性（图1）。花生、黑豆、黄豆、豇豆、黄秋葵、向日葵上的真菌均为白色菌丝，培养5 d后产生紫红色色素；蕹菜上的真菌KXC-1培养5 d后在菌落表面产生灰绿色的孢子；萝卜上的真菌LB-1则生长迅速，培养48 h即可长满培养皿（直径9 cm），并产生黑色的孢子（图2、3）。

图1 部分芽菜细菌分离物在25 ℃、NA平板上培养24 h后的形态

图2 8种芽菜病原真菌在25 ℃、PDA平板上培养7 d后的形态

图3 部分芽菜真菌孢子形态

2.3病原微生物分子生物学鉴定结果

采用引物27F和1492R扩增得到的不同细菌菌株的DNA片段长度约为1 400 bp；采用引物ITS1和ITS4扩增得到的不同真菌菌株的rDNA-ITS片段长度约为700 bp（图4）。

经BLAST比对分析，本试验分离得到的24株细菌分属8个属，分别为克雷伯氏菌属（Klebsiella）、肠杆菌属（Enterobacter）、假单胞菌属（Pseudomonas）、不动杆菌属（Acinetobacter）、果胶杆菌属（Pectobacterium）、短稳杆菌属（Empedobacter）、戴尔福特菌属（Delftia）和从毛单孢菌属（Comamonas）。所有24株细菌均为革兰氏阴性菌，其中，不动杆菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属和假单胞菌属的细菌分布于2种或2种以上的芽菜上；果胶杆菌属和戴尔福特菌属的细菌只出现在黄秋葵芽菜上；短稳杆菌属和从毛单孢菌属的细菌则只出现在向日葵芽菜上（表1）。

图4 ITS序列扩增产物电泳检测结果

本试验分离得到的8株真菌分属3个属，分别为镰刀菌属（Fusarium）、链格孢属（Alternaria）和根霉属（Rhizopus），其中镰刀菌属的真菌分布于6种芽菜上；链格孢属和根霉属的真菌仅分别出现在蕹菜和萝卜芽菜上（表2）。

表1 基于16S rDNA测序对8种芽菜上分离得到的24株细菌的鉴定结果

表2 基于ITS测序对8种芽菜上分离得到的8株真菌的鉴定结果

2.4回接试验结果

接种细菌菌液培养5 d后，萝卜芽菜和蕹菜芽菜平均发病率分别为10%和20%；接种不同的病原菌腐烂程度不同，但发病症状相似。发病芽体呈水浸状、褐色腐烂，有臭味，同时在下胚轴的中上部产生褐色菌膜（图5）。培养7 d后2种芽菜的发病率均达到100%。

接种真菌孢子悬浮液4 d后，黑豆芽菜开始发病，接种镰刀菌的芽菜下胚轴的中上部产生水渍状病斑，芽体表面出现白色菌丝（图6），接种8 d后白色菌丝发展为团状菌落，周围的芽菜均产生腐烂症状；接种根霉与链格孢的芽菜表面也有白色菌丝产生，并产生黑色和褐色的孢子，同时芽体产生水渍状病斑，由于菌丝生长迅速，接种5 d后所有芽菜表面均布满根霉或者链格孢的菌落，大量芽菜腐烂，失去食用价值。

回接试验第8天，对照芽菜发病率仅为5.6%。

图5 接种细菌5 d后萝卜和蕹菜芽菜的发病症状

图6 接种真菌后黑豆芽菜的发病症状

3　结论与讨论

张丽等（2010，2011）对豆芽烂芽的病原菌分离鉴定及致病性研究表明，豆芽生产中的主要真菌病害是瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum）以及立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）引起的腐烂病。本试验结果表明，镰刀菌同样可致花生、黑豆、黄豆、豇豆、黄秋葵和向日葵芽菜腐烂；根霉和链格孢更是引发萝卜芽菜和蕹菜芽菜腐烂的主要病原真菌。

本试验分离得到的24株细菌分属8个属，除果胶杆菌属外，均为环境腐生微生物，其中不动杆菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属和假单胞菌属是最为常见的食源性微生物，也是人类的机会致病菌。产生这种现象的原因很可能是芽菜生产中对种子的精选和消毒处理降低了植物病原菌的种群数量，而环境微生物成为了主要微生物群体。因此，在芽菜腐烂病防控措施上，既要严格进行种子消毒，更应重视生产过程的环境灭菌，以减少环境微生物污染。

果胶杆菌属细菌和戴尔福特菌属细菌只出现在黄秋葵芽菜上，短稳杆菌属细菌和从毛单孢菌属细菌则只出现在向日葵芽菜上；链格孢属真菌和根霉属真菌分别仅出现在蕹菜芽菜和萝卜芽菜上，其分布呈现出一定的专一性，说明不同种类芽菜上的微生物分布规律不尽相同。

在国外，芽菜上的微生物如大肠杆菌、沙门氏菌等既是重要的环境微生物，又是重要的食源性微生物和机会致病菌，其中大肠杆菌E.coli O157：H7还导致了一些公共卫生事件，是研究的热点（Erickson，2012）。我国对于芽菜上的食源性微生物的研究极少，亟须开展。

参考文献

方中达．1996．植病研究方法．3版．北京：中国农业出版社．

康玉凡，陶礼明，毛振宾，罗珊．2008．工厂化豆芽成为现代加工食品新宠．长江蔬菜，（9）：73-76．

李振华，段玉，康玉凡．2011．豆类芽菜生产工艺的研究进展．中国农学通报，27（10）：76-81．

袁星星，陈新，陈华涛，崔晓艳，顾和平，张红梅．2014．豆类芽菜生产技术研究现状及发展方向．江苏农业科学，42（5）：136-139．

张丽，吴小刚，张力群，康玉凡，梁海荣．2010．豆芽烂芽的病原菌分离鉴定及致病性研究．长江蔬菜，（2）：71-74．

张丽，张立群，段会梅，康玉凡，吕玉兰．2011．豆芽立枯病诊断与防治试验．中国蔬菜，（4）：61-65．

Erickson M C．2012．Internalization of fresh produce by foodborne pathogens．Annual Review of Food Science and Technology，3：283-310．

Innis M A，Gelfand D H，Sninsky J J，White T J．1990．PCR protocols：a guide to methods and applications．San Diego：Academic Press．

Isolation and Identification of Eight Microorganism Causing Sprout Disease

ZHANG An-hua1，CAI Xiang2，CHEN Tao3，WANG Ping1，ZHU Ju-hong1，ZHAO Zhi-yuan1
（1Institute of Crop Sciences，Wuhan Academy of Agriculture Science and Technology，Wuhan 430345，Hubei，China；2Wuhan Weierfu Biological Technology Co.，Ltd，Wuhan 430345，Hubei，China；3Hubei Weimin Biological Technology Co.，Ltd，Wuhan 430207，Hubei，China）

Abstract：Twenty-four bacteria and 8 fungi were isolated from 8 different kind industrial producing sprouts．Molecular identification showed that these 24 bacteria belong to 8 genus（Klebsiella，Enterobacter，Pseudomonas，Acinetobacter，Pectobacterium，Empedobacter，Delftia and Comamonas），and were all G-，and 7 of them were not typical plant pathogen，except Pectobacterium．Four genus（Acinetobacter，Enterobacter，Klebsiella and Pseudomonas）were isolated from 2 or over 2 sprouts，and the other 4 genus were only isolated from one kind sprout．The result implied that there was host specialization in these bacteria．Eight fungi belong to 3 genus（Fusarium，Alternaria and Rhizopus）．Fungi isolated from the other 6 sprouts all belong to Fusarium，Alternaria and Rhizopus fungi were only isolated from water spinach and radish sprout，respectively．The water spinach and radish sprouts showed different rot symptoms after inoculated by 4 bacteria，and the black soya bean sprouts showed different rot symptoms after inoculated by 3 fungi．These results indicated that microorganism from environment during production process could also cause sprout diseases．

Key words：Sprout；Microorganism；Bacteria；Fungi；Identification

收稿日期：2015-10-21；接受日期：2016-01-24

基金项目：武汉市科技局关键技术攻关项目（2014020202010135）