IL-32对HepG2 2.15细胞凋亡的影响*

潘兴飞，　孙媛丽，　贺　琪，　尹旺春，　符明鹏，　沈关心，　朱慧芬△

1广州医科大学附属第三医院感染科，广州　510150　2 华中科技大学同济医学院基础医学院免疫学系，武汉　430030

IL-32对HepG2 2.15细胞凋亡的影响*

潘兴飞1，孙媛丽2，贺琪2，尹旺春2，符明鹏2，沈关心2，朱慧芬2△

1广州医科大学附属第三医院感染科，广州5101502华中科技大学同济医学院基础医学院免疫学系，武汉430030

摘要：目的研究白细胞介素-32(IL-32)对乙型肝炎病毒(HBV)感染的肝细胞(HepG2 2.15细胞，插入HBV全基因组，持续表达)凋亡的影响。方法将不同浓度的IL-32(0～0.4 μg/mL)蛋白质与HepG2细胞、HepG2 2.15细胞共培养，48 h后用MTT检测细胞增殖。收集与IL-32共培养48 h的HepG2细胞、HepG2 2.15细胞，加入Annexin Ⅴ和PI，室温避光孵育15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡。将IL-32(0.2 μg/mL)与HepG2细胞、HepG2 2.15细胞共培养，分别于0、12、24 h后收集细胞，Human Active Caspase-3 Immunoassay检测试剂盒检测活化的Caspase-3表达水平，Caspase-3 Colorimetric检测试剂盒检测Caspase-3酶活性。结果IL-32抑制HepG2细胞、HepG2 2.15增殖，诱导HepG2细胞、HepG2 2.15细胞凋亡，且随着IL-32浓度的增高，细胞凋亡水平亦增高。IL-32诱导HepG2细胞、HepG2 2.15细胞活化的Caspase-3表达水平及Caspase-3酶活性均增加。结论IL-32可能通过活化Caspase-3通路诱导HBV感染的肝细胞凋亡而发挥抗病毒作用，同时亦参与慢性乙型病毒性肝炎肝损伤的发生。

关键词：白细胞介素-32；肝细胞；乙型肝炎病毒；细胞凋亡；Caspase-3

白细胞介素-32(interleukin-32，IL-32)是一种促炎症细胞因子，可以通过活化NF-κB、p38MAPK等信号通路诱导TNF-α、IL-8、IL-1β、等细胞因子表达[1]，导致细胞因子网络活化，亦可影响细胞的生长、凋亡。研究发现IL-32可以诱导活化的T细胞凋亡，HeLa细胞中IL-32增高则HeLa细胞凋亡增加，降低HeLa细胞中的IL-32则HeLa细胞凋亡减少[2-3]。我们前期研究证实慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B，CHB)肝组织中IL-32表达增高，且其表达水平与肝组织炎症、纤维化程度呈正相关[4]。因此，本研究在细胞水平检测IL-32对肝细胞凋亡的影响及机制。

1材料与方法

1.1细胞株及试剂

人肝癌细胞株HepG2、HepG2 2.15细胞(插入HBV全基因组，持续表达)为华中科技大学同济医学院免疫学实验室保存。重组人IL-32蛋白购自美国R&D公司。凋亡检测试剂盒(Alexa Fluor®488 Annexin Ⅴ/Dead Cell Apoptosis Kit)购自美国Invitrogen公司。Human Active Caspase-3 Immunoassay检测试剂盒购自美国R&D公司。Caspase-3 Colorimetric检测试剂盒购自美国BioVision公司。

1.2MTT法检测细胞增殖

MTT法参照文献[5]报道。简要步骤如下：将HepG2细胞、HepG2 2.15细胞接种至96孔板，将不同浓度的IL-32(0～0.4 μg/mL)分别与HepG2细胞、HepG2 2.15细胞共培养48 h，然后每孔加入MTT 10 μL，继续培养4 h，再加入细胞裂解液100 μL，将细胞置于微量振荡器上轻轻振荡15 min，在酶标仪上读取A值。抑制率(%)=(1-实验组A值/空白组A值)×100%。

1.3检测细胞凋亡

12孔板的每个孔铺入1.5×105细胞，培养24 h，加入不同浓度的IL-32(0～0.4 μg/mL)与之共培养，48 h后收集细胞，加入Annexin Ⅴ和PI孵育。首先用Alexa Fluor®488 Annexin Ⅴ/Dead Cell Apoptosis Kit与IL-32处理过的细胞共孵育，按Invitrogen公司说明书操作。具体步骤如下：用0.05%的胰酶将贴壁的细胞消化下来；用1 200 r/min离心机室温离心收集细胞；用预冷的PBS洗细胞2次；再用1×Annexin-binding缓冲液100 μL将细胞重悬；加入Alexa Fluor®488 Annexin Ⅴ 5 μL和100 μg/mL PI工作液1 μL，室温避光孵育15 min；再加入1×Annexin-binding缓冲液400 μL，轻轻混匀；最后用流式细胞仪检测凋亡。

1.4检测Caspase-3活化水平

用Human Active Caspase-3 Immunoassay检测试剂盒检测细胞Caspase-3活化水平。将IL-32(0.2 μg/mL)分别与HepG2细胞、HepG2 2.15细胞共培养，分别于0、12、24 h后收集细胞，检测活化Caspase-3表达水平，具体步骤参照试剂盒所提供的说明书操作。

1.5检测Caspase-3酶活性

用Caspase-3 Colorimetric检测试剂盒检测Caspase-3酶活性。将IL-32(0.2 μg/mL)分别与HepG2细胞、HepG2 2.15细胞共培养，分别于0、12、24 h后收集细胞，检测Caspase-3酶活性，具体步骤参照试剂盒所提供的说明书操作。

1.6统计学方法

2结果

2.1IL-32抑制HepG2细胞、HepG2 2.15细胞增殖

用MTT法检测IL-32对细胞增殖的影响，从表1可以看出，IL-32可以抑制HepG2细胞、HepG2 2.15细胞增殖，随IL-32浓度的增高，其对细胞增殖抑制作用增强。

表1IL-32对HepG2细胞、HepG2 2.15细胞增殖的影响

Table 1　Effect of IL-32 on the proliferation of HepG2 and

IL-32(μg/mL)HepG2细胞A值抑制率(%)HepG22.15细胞A值抑制率(%)00.62±0.0500.58±0.0300.10.50±0.04100.49±0.01120.20.35±0.06250.30±0.02290.40.28±0.02 50*0.23±0.01 55*

与对照组(0 μg/mL IL-32)比较，*P<0.05

2.2IL-32诱导HepG2、HepG2 2.15细胞凋亡

为了研究IL-32增高对细胞凋亡的影响，我们用商品化的IL-32蛋白(0～0.4 μg/mL)与细胞共培养，48 h后用流式细胞仪检测细胞凋亡水平。如图1所示，IL-32可诱导HepG2细胞凋亡，且随着IL-32浓度的增高，细胞凋亡水平增高。进一步检测IL-32对HepG2 2.15细胞凋亡的影响，以明确IL-32对HBV感染细胞凋亡的作用，如图1所示，IL-32可诱导HepG2 2.15细胞凋亡，且随着IL-32浓度的增高，细胞凋亡水平亦增高。

2.3IL-32诱导活化的Caspase-3表达增加

Caspase-3是内源性、外源性凋亡通路共有的重要效应酶，活化的Caspase-3发挥诱导凋亡的作用。凋亡检测发现0.2 μg/mL的IL-32蛋白质即显著诱导肝细胞凋亡，因此我们用浓度为0.2 μg/mL的IL-32蛋白与HepG2细胞、HepG2 2.15细胞共培养，分别共培养0、12、24 h后收集细胞，检测活化的Caspase-3表达水平。如图2所示，IL-32诱导活化的Caspase-3表达增加，且随着IL-32刺激时间的延长，活化的Caspase-3表达水平亦增高。

2.4IL-32诱导Caspase-3酶活性增强

将IL-32(0.2 μg/mL)与HepG2细胞、HepG2 2.15细胞共培养，分别于0、12、24 h后收集细胞，检测Caspase-3酶活性。如图3所示，IL-32诱导Caspase-3酶活性增强，且随着IL-32刺激时间的延长，Caspase-3酶活性亦增高。

图2　0.2 μg/mL IL-32诱导HepG2细胞(A)、HepG2 2.15细胞(B)活化的Caspase-3表达Fig.2 Expression of activated caspase-3 in HepG2(A)and HepG2 2.15 cells(B)induced by IL-32(0.2 μg/mL)

图3　0.2 μg/mL IL-32诱导HepG2细胞(A)、HepG2 2.15细胞(B)Caspase-3酶活性增强Fig.3 Increase of caspase-3 enzyme activities in HepG2(A)and HepG2 2.15 cells(B)induced by IL-32(0.2 μg/mL)

3讨论

本研究发现IL-32抑制HepG2细胞、HepG2 2.15细胞增殖，诱导HepG2细胞、HepG2 2.15细胞凋亡，且随着IL-32浓度的增高，细胞凋亡水平亦增高。促炎症细胞因子IL-32，既可呈分泌性表达，诱导活化局部细胞因子网络，参与丙型病毒性肝炎肝纤维化[6]、炎症性肠病[7]等炎症性疾病的发病，又可诱导HeLa细胞凋亡，在宫颈炎、宫颈癌的发病中起重要作用[2-3]。我们的前期研究发现CHB患者肝组织中IL-32表达增高，且其表达水平与肝组织炎症及纤维化程度呈正相关[4]，但IL-32引起肝组织炎症是否与导致肝损伤有关尚未完全明确。

我们前期研究亦发现HBV及其编码的蛋白HBx可以诱导肝细胞表达IL-32[8]，本研究发现IL-32随浓度增高而诱导HBV感染细胞凋亡增加。细胞凋亡是病毒性肝炎肝损伤的重要原因，反复的肝细胞损伤、修复是导致肝纤维化发生的重要原因。结合我们前期研究结果，我们推测IL-32可能通过诱导HBV感染细胞凋亡而导致肝损伤，参与CHB肝损伤的发生。

细胞凋亡是活体组织必须的生物过程，细胞凋亡过程被内源性、外源性两种通路介导，Caspase-3是内、外源凋亡通路共有的重要效应酶，Caspase-3活化导致维持细胞生存、死亡的蛋白降解，引起凋亡发生[9]。研究发现IL-32可诱导结核杆菌感染的THP-1细胞凋亡，IL-32表达增高的THP-1细胞活化的Caspase-3表达增加，Caspase-3抑制剂可降低IL-32诱导的THP-1细胞凋亡，由此认为IL-32可通过诱导THP-1细胞凋亡而抑制结核杆菌感染，并对机体具有保护作用[10]。本研究发现IL-32可诱导HepG2细胞及HepG2 2.15细胞凋亡，IL-32与HepG2细胞及HepG2 2.15细胞共培养后Caspase-3活化增加，而且Caspase-3酶活性亦增加，我们认为IL-32可能通过诱导Caspase-3活化、增加Caspase-3酶活性导致凋亡通路活化，从而诱导肝细胞凋亡。此外，我们发现HepG2 2.15细胞凋亡水平、HepG2 2.15细胞活化的Caspase-3表达水平、HepG2 2.15细胞Caspase-3酶活性均高于HepG2细胞，我们推测可能与HepG2 2.15细胞有HBV存在，机体因此而产生更强的保护机制，导致凋亡程度更强，以抑制HBV感染有关。

最新的研究发现CHB患者肝组织中Caspase-3表达增高，Caspase-3表达增高的肝细胞凋亡增加[11-12]。我们的前期研究发现CHB患者肝组织中IL-32表达增高，且其表达水平与肝组织炎症程度呈正相关。结合本研究结果，进一步证实IL-32可能通过活化Caspase-3而诱导HBV感染细胞凋亡，导致肝损伤发生。

综上所述，本研究发现IL-32可抑制HepG2细胞、HepG2 2.15细胞增殖，诱导HepG2细胞凋亡、HepG2 2.15细胞凋亡，其可能通过活化Caspase-3、增强Caspase-3酶活性而诱导凋亡通路活化。因此，我们认为IL-32可能通过诱导HBV感染细胞凋亡而发挥抗病毒作用，同时亦导致CHB肝损伤的发生。

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(2015-12-22收稿)

Effect of Interleukin-32 on the Apoptosis of HepG2 2.15 Cells

Pan Xingfei1，Sun Yuanli2，He Qi2etal

1DepartmentofInfectiousDiseases，The3rdAffiliatedHospital，GuangzhouMedicalUniversity，Guangzhou510150，China2DepartmentofImmunology，SchoolofBasicMedicalSciences，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

AbstractObjectiveTo investigate the effect of interleukin-32(IL-32)on the apoptosis of HepG2 2.15 cells in which the whole genome of HBV was inserted and persistently expressed.MethodsHepG2 cells or HepG2 2.15 cells were treated with different concentrations of IL-32(0-0.4 μg/mL).Forty-eight hours later，cell proliferation was assayed by MTT method.Cell apoptosis was assayed by flow cytometry(FCM)after treatment of both cells with IL-32 for 48 h，and then with annexin Ⅴ and PI at room temperature in the dark for 15 min.Subsequently，HepG2 cells or HepG2 2.15 cells were co-cultured with IL-32 at 0.2 μg/mL.They were collected at 0，12，24 h，respectively.Activated caspase-3 expression levels were assayed by using Human Active Caspase-3 Immunoassay Kit.Caspase-3 enzyme activities were detected by Caspase-3 Colorimetric Assay Kit.ResultsIL-32 could inhibit the proliferation of HepG2 cells and HepG2 2.15 cells，and induce their apoptosis in a dose-dependent manner.Activated caspase-3 expression levels and caspase-3 enzyme activities were increased in both HepG2 and HepG2 2.15 cells co-cultured with IL-32.ConclusionIL-32 play an anti-viral role by activating the caspase-3 pathway and inducing the apoptosis of HBV-infected hepatocytes，and it is involved in the liver damage of chronic hepatitis B at the same time.

Key wordsIL-32；hepatocytes；hepatitis B virus；cell apoptosis；caspase-3

中图分类号：R392.114

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.03.003

*国家自然科学基金资助项目(No.81401306，No.81373152)；广州医科大学附属第三医院博士启动基金(No.2014Y02)

潘兴飞，男，1980年生，主治医师，E-mail：panxing0125@163.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：huifzhu12@hotmail.com