水质中叶绿素a检测方法的改进和探讨

李　征，胡新跃.北京市丰台区环境保护局，北京　0007 .北京市朝阳区环境保护局，北京　005



水质中叶绿素a检测方法的改进和探讨

李征1，胡新跃2
1.北京市丰台区环境保护局，北京100071 2.北京市朝阳区环境保护局，北京100125

摘要叶绿素a是地表水监测的常规项目，是水体初级生产力的重要指标。目前实验室主要采用国家环保总部《环境监测技术规范》（第四册）中规定的分光光度法测定叶绿素a，在大量的实际研究工作中发现，分光光度法测量叶绿素a存在一定的缺陷。缺陷主要表现在叶绿素的提取过程中，为此我们将对原有方法进行改进。本文通过对规范方法与改进的浸提方法和超声法等进行实验比对，找出稳定性好，结果准确，操作简单同时又能减少丙酮对操作者毒害作用的方法。

关键词叶绿素a的提取；监测方法；方法比较与改进

目前，通过生物学指标监控河湖污染情况渐成趋势，其中浮游植物是一项重要的研究对象。由于叶绿体是浮游植物的重要功能器官，其功能的强弱及其时空的动态变化，是通过叶绿素的光合作用实现的。因此，目前对叶绿素a的监测是了解水质污染状况及其动态特征的有效方法。

按照北京市环境保护局的要求，自2007年起笔者就开始对朝阳区辖区内的湖泊（主要包括朝阳公园的水碓湖、红领巾公园湖和奥林匹克公园湖）进行叶绿素a的测定，以评价这些湖泊的富营养化程度。2012年带领丰台监测站取得了叶绿素a检测的资质，检测过程中积累了一些经验，同时在监测过程中也发现了许多问题。为了提高叶绿素a监测的准确性，简化检测操作程序，保证检测人员身体健康，我们对现有的监测方法进行了尝试性地改进。

1　现阶段叶绿素a检测情况概述

目前，测定叶绿素a没有国标方法。现在环保系统采用的叶绿素a监测方法主要依据是《水和废水监测分析方法（第四版）》中的水质叶绿素a的测定的分光光度法。该方法测定叶绿素a的基本原理是：通过抽滤的方法将附着在滤膜上的藻类，溶解在90%的丙酮溶剂中，以反复研磨和离心的方法提取叶绿素a。该方法的优点是能充分将藻类植物的细胞壁破碎，对叶绿素的提取速度较快。

在实际检测中我们发现，该方法的主要缺点在于研磨过程中叶绿素a容易发生光降解，同时因为反复转移操作及易产生损失，使结果偏低、误差较大，此外研磨过程中操作人员与丙酮接触时间长，不利于操作人员的健康。

为此我们主要从溶剂、提取方式、温度和时间控制等方面对原有方法进行改进。本文通过对规范方法与改进的浸提方法和超声法等进行实验比对，找出稳定性好，结果准确，操作最为简单的方法。

2　分光光度法测叶绿素a步骤及问题

2.1实验材料

地表水水样（每次量取100ml）。

仪器设备：722S分光光度计、真空泵、玻璃抽滤器、TDZ5-W5多管架自动平衡离心机、孔径0.45μm乙酸纤维滤膜、电动玻璃匀浆机、无水碳酸镁粉末、90%丙酮。

2.2常规实验操作方法

1）水样抽滤：在抽滤器上装好0.45μm的乙酸纤维滤膜。倒入100ml的水样进行抽滤，水样抽完后，继续抽1min～2min，以减少滤膜上的水分。

2）样品提取：将带有浮游植物的滤膜取出放在冰箱内低温干燥6h～8h后放入组织研磨器中，加入少量无水碳酸镁粉末及2m1～3m1的90%的丙酮，充分研磨，提取叶绿素a。用离心机在3 000r转速下离心lOmin。将上清液倒入lOml容量瓶中。之后将剩余固形物倒入组织研磨器中，用2m1～3ml的90%的丙酮，继续研磨提取，离心lOmin，并将上清液再转入容量瓶中。重复1～2次，用90%的丙酮定容为lOml，摇匀。

3）测定：用1cm光程的比色皿，分别读取750nm，663nm，645nm，630nm波长的吸光度，并以90%的丙酮作空白吸光度测定，对样品吸光度进行校正［1］。

2.3叶绿素a监测方法目前存在的问题

1）操作误差：由于操作过程中反复转移样品，样品比较粘稠，容易产生较大的人为操作误差。同时由于叶绿素a对光照及温度敏感，在研磨过程中摩擦生热也会造成一定的叶绿素损失。

2）安全性。由于丙酮挥发性大，有神经毒性，对操作人员身体健康有损害。组织研磨器是玻璃制品，在操作过程中易发生破碎，有安全隐患。

3　叶绿素a不同改进方法的比较

3.1反复冻融-浸提法

抽滤步骤和比色步骤与规范法相同，将研磨步骤改为将过滤水样后的滤膜装进黑色塑料袋，于-20℃冰箱和室温下反复冻融3～5次，再放进盛有10ml丙酮（90%）的离心管中振摇1min后，于4℃冰箱浸提20h，浸提过程需振摇1～2次［2］。实验结果见表1。

表1 研磨法与反复冻融-浸提法对比实验结果

从表1中可以看出，采用反复冻融-浸提法所得的叶绿素a平均值明显高于研磨法，两者之间存在明显差异。且研磨法平行样的标准偏差较大，主要是受人为因素影响，浸提法减少了研磨和转移过程中叶绿素a的损耗，人为误差小，稳定性好。

3.2超声波提取方法

抽滤步骤和比色步骤与规范法相同，将研磨步骤改为直接将加了碳酸镁粉末的滤膜碎片置于离心管中，加入90%丙酮，将离心管用黑色塑料袋包裹后超声破碎10min，振荡器振摇（300r/min）萃取1h，离心机（10 000r/min）离心10min，之后将上清液转入10ml棕色容量瓶中，用90%丙酮定容至10ml，摇匀待测［3］。实验结果见表2。

表2　超声法与研磨法提取结果比较

实验结果表明，与传统的研磨法相比较，超声法测定叶绿素a的提取效率优于研磨法。

3.3乙醇替代提取液法

由于丙酮具有神经毒性，对操作人员的身体健康有毒害作用，因此，在操作过程中尝试用安全的乙醇替代丙酮进行提取。实验方法是将抽滤后的干燥滤膜在乙醇溶液中浸泡过夜，在进行研磨提取和离心提取部分，实验结果见表3。

表3　乙醇替代提取液丙酮法对比实验结果

从表3中可以看出，在浸泡提取一天之后，乙醇的提取能力接近丙酮的提取效果，可以考虑乙醇替代丙酮溶剂，增加浸泡提取时间。

4　结论

1）通过上面实验比较可以看出，规范操作法由于研磨过程中样品容易损失导致实验结果偏低，应进一步进行改进。

2）超声法测定叶绿素a的提取效率优于丙酮—研磨法，且操作简便，节省时间，效率高，重复性好，有可比性，安全性优，保障健康，能减少系统操作误差。

3）反复冻融-浸提法在操作更为简单，提取效率主要通过反复冻融对胞壁的破坏和浸提时间的延长来实现，该方法大大减少了操作者与丙酮的接触时间，降低了丙酮的毒害作用，同时具有较好的稳定性。

4）用乙醇替代丙酮溶液，虽然提取效果比丙酮溶剂略逊，但是可以通过增加浸提时间来减少差距，总体来讲乙醇具备替代丙酮作为提取溶剂的条件，但要在方法上做更多改进来提高乙醇的提取效率。

参考文献

［l］国家环境保护总局.水和废水监测分析方法.北京：中国环境科学出版社.

［2］刘秀丽，宋平，孙成明.植物叶绿素测定方法的再探讨［J］.江苏农业研究，1999（3）：46-47.

［3］吴志旭，张雅燕.2002.浮游植物体内叶绿素a测定方法的改进［J］.化学分析计量，2002，11（6）：37-38.

中图分类号X3

文献标识码A

文章编号1674-6708（2016）165-0217-02

作者简介：李征，北京市丰台区环境保护局。胡新跃，北京市朝阳区环境保护局。