甘草对去势大鼠骨质疏松症骨形态计量学影响的研究

徐桃桃,刘仁斌,陈　峰,赵光恒,李成刚

(湖北省十堰市人民医院(湖北医药学院附属医院)，湖北 十堰 442000)

甘草对去势大鼠骨质疏松症骨形态计量学影响的研究

徐桃桃,刘仁斌,陈峰,赵光恒,李成刚

(湖北省十堰市人民医院(湖北医药学院附属医院)，湖北 十堰 442000)

[摘要]目的观察甘草对去势大鼠骨质疏松症模型骨组织结构的影响，探讨其干预骨质疏松的作用机制，为临床研究提供实验依据。方法建立去势大鼠骨质疏松模型，将造模成功的45只雌性SD大鼠按随机数字法分为去势组、甘草汤低剂量组、甘草汤高剂量组，每组15只。去势组给予生理盐水灌胃，甘草汤低剂量组和甘草汤高剂量组分别给予甘草汤剂2 mL和4 mL灌胃，每周1次，连续16周。末次灌胃后24 h取大鼠胫骨组织，制作冰冻切片冯库萨(von kossa)钙染色观察骨组织形态结构，采用免疫组化和图像分析技术测定骨小梁结构的表达情况。结果去势组仅骨小梁结构少量表达；甘草汤低剂量组骨小梁组织表达相对增强，骨小梁数量增多、相对体积增大、分离度减小；甘草汤高剂量组骨小梁组织表达明显增强，骨小梁数量、相对体积进一步增大而分离度显著减小。甘草汤高、低剂量组骨小梁组织阳性目标总面积、骨小梁总周长及骨小梁数量均明显高于去势组(P均<0.05)，骨小梁分离度明显低于去势组 (P均<0.05)。结论甘草能够增加成骨细胞中骨小梁的数量而保护骨组织，增加骨量,并能防止骨基质的丢失,从而增加骨的韧性，可用于绝经后骨质疏松症的治疗。

[关键词]甘草；去势大鼠；骨质疏松症；骨形态计量学

骨质疏松症(Osteoporosis，OP)是一种以骨强度下降导致骨折危险性增加的骨骼疾病，严重危及中老年人的生活质量，并成为危害公共健康问题之一[1]。女性在绝经或绝经后期骨丢失逐渐加速，继而随年龄增长发生骨矿物质密度降低，骨的脆性增高，骨折危险性增加，更易于罹患此病[2]。雌激素缺乏是引起绝经后骨质疏松症的公认因素，雌激素替代疗法(ERT)是防治和治疗绝经后骨质疏松症以及预防骨折的首选方案[3]，但因长期使用雌激素类药物有导致乳腺癌、子宫内膜癌的潜在危险，且存在价格昂贵等弊端，使患者难以长期坚持。因此，选用毒副作用小、标本兼治并可长期服用的中草药治疗绝经后骨质疏松症已成为国内医学界的研究热点。随着现代医学的发展, 中药疗效的细胞、分子生物学机制逐渐被发现，为中药治疗的现代化和国际化创造了有利条件。甘草是一味应用极其广泛的传统中药，其有效成分黄酮类、三萜类、多糖等化合物本身或经过加工、修饰、改造，可以获得高活性的抗骨质疏松药物。因此，本实验通过手术切除成年雌性大鼠双侧卵巢方法,模拟妇女绝经状态,观察不同剂量甘草提取液对去势卵巢大鼠骨质疏松症的骨形态计量学的影响，旨在为甘草防治骨质疏松症提供实验依据。

1实验资料

1.1实验动物清洁级健康雌性SD大鼠45只，6月龄，体质量(200±20)g，购自湖北医药学院S动物实验中心(SPF级)，动物质量合格证号：SCXK(鄂)2011-0008。实验过程中，大鼠分笼于塑料笼内饲养，每笼5只，笼盖上用透气通风的透明塑料遮挡，保持笼内清洁，经常清理笼内异物。给予大鼠标准饲料，控制食量(20±1)g/d，自由饮水及活动。

1.2主要药品、试剂与仪器设备甲基丙烯酸甲酯，沈阳市新化试剂厂生产；邻苯二甲酸二丁酯、过氧化苯甲酰，北京永定化工厂生产；3%戊巴比妥钠，上海化学试剂采购供应站分装厂,批号：950427；碱性磷酸酶检测试剂盒，广州标佳科技有限公司，批号：2400083；冰冻切片冯库萨(von kossa)钙染色试剂盒，上海杰美医药科技有限公司，批号：GMS80045.2；全自动生化分析仪：日立71-800； NIKON YX2-H 显微镜；切片石蜡机(上海标本模具厂，Q/YSQN.40.91)；NIKON Spot 图像采集系统(湖北医药学院基础医学院提供)；Image-pro plus 软件；Jung K骨切片机；物理天平、烘箱、量筒、包埋用小玻璃瓶若干等。

1.3动物造模及分组在无菌条件下，取大鼠下腹正中切口，切除双侧卵巢，结扎输卵管及伴行的血管，缝合切口，术时均予3%戊巴比妥钠溶液按0.1 mL/100 g腹腔麻醉。术后将实验动物随机分为去势组、甘草汤低剂量组、甘草汤高剂量组，每组15只。

1.4药物制备与给药方法取甘草100 g加水500 mL,煎煮浓缩至50 mL，分装到2 mL的一次性试管中，4 ℃保存。术后第2周伤口愈合后，去势组给予生理盐水2 mL/只灌胃，甘草汤低剂量组给予甘草汤剂2 mL/只灌胃，甘草汤高剂量组给予甘草汤剂4 mL/只灌胃，均每周1次，一直持续到第17周。

1.5实验样本的获取末次灌胃后24 h内以腹主动脉放血法处死大鼠，迅速取双侧胫骨仔细剥离附着肌肉、结缔组织。胫骨用生理盐水冲洗，放入4%甲醛溶液中固定24 h以上，10%福尔马林溶液固定 5～7 d， 流水冲洗，用70%，80%，90%，95% 和 100% 乙醇进行逐级脱水并透二甲苯透明24 h，常规石蜡包埋，von kossa 染色(不显示钙质)，制作病理学切片，片厚5 μm，光学显微镜观察骨小梁的变化并摄像，其中骨小梁为棕黑色，其他为黄色。

1.6骨组织形态计量学测量骨组织形态计量学的动态和静态参数在胫骨近端干骺端生长板下1～5 mm范围内的次级松质骨(Secondary Spongiosa)中测量，每只大鼠随机选3张切片，每张切片以单盲法在次级松质骨范围内随机选取3个视野，以细胞质清晰棕黑为阳性。采用图像分析软件Image-Pro plus 6.0，根据文献[4]方法标准对骨小梁阳性部位进行原位定量检测，每张切片随机选用3个视野(10×40)，自动选取阳性部位并计算相对IOD 值，并将骨组织切片在显微镜下放大200倍，每组随机选取直径完整的胫骨纵截面30个，测定骨组织面积(T.Ar)、骨小梁面积(Tb.Ar)、骨小梁周长(Tb.Pm)，采用公式计算骨小梁分离度(Tb.Sp)：2 000/1.199×(T.Ar-Tb.Ar)/Tb.Pm，骨小梁数量(Tb.N)：1.199/2 ×Tb.pm/T.Ar，骨小梁厚度(Tb.Th):2 000/1.199× Tb.Ar/Tb.Pm，进行图像数据分析及统计。

2结果

2.1各组胫骨组织病理学表现去势组仅骨小梁结构少量表达；甘草汤低剂量组骨小梁组织表达相对增强，骨小梁数量增多、相对体积增大、分离度减小；甘草汤高剂量组骨小梁组织表达明显增强，骨小梁数量、相对体积进一步增大而分离度显著减小。见图1～3。

图1　去势组胫骨组织病理学表现(von kossa染色，×100)

图2　甘草汤低剂量组胫骨组织病理学表现(von kossa染色，×100)

图3　甘草汤高剂量组胫骨组织病理学表现(von kossa染色，×100)

2.2各组胫骨组织形态计量学结果甘草汤高、低剂量组骨小梁组织阳性目标总面积、骨小梁总周长及骨小梁数量均明显高于去势组(P均<0.05)，骨小梁分离度明显低于去势组(P均<0.05) 。见表1。

表1　各组胫骨组织形态计量学结果±s )

注：①与去势组比较，P<0.05。

3讨论

关于骨质疏松症的病因，尚不够完全明确，传统观点证实，骨质疏松症主要与内分泌代谢紊乱、机械性力学、骨的老化、年龄、遗传等因素有关。然而，最近国外研究提出了骨免疫学的观点，认为在骨质疏松发生发展过程中，免疫系统和免疫因素起了重要的调节作用，即骨髓中免疫系统的发育，依赖于骨细胞营造的微环境，并且骨组织在获得性免疫中也会发挥调节作用，同时免疫系统可通过淋巴细胞、树突细胞、细胞因子等调控骨代谢[5]。Wang等[6]研究发现绝经后骨质疏松症发生和发展可能是由于骨髓间充质干细胞成骨分化能力及增殖能力的下降而造成的，即正常骨髓间充质干细胞能够向成骨、成软骨等不同细胞系分化并保持平衡，当骨髓间充质干细胞的分化能力改变时可能会导致疾病的发生。目前研究发现植物中的某些成分可以作为一些免疫调节因子，降低破骨细胞活性，提高成骨细胞的建造能力，增加骨小梁的数量，从而为治疗骨质疏松开辟了新的方向。中药甘草已被分离出多种黄酮类化合物、三萜类化合物以及香豆素类、多种氨基酸、生物碱、雌性激素和多种有机酸等物质，已被证实有调节免疫、抗癌、抗炎、降压降脂、美白等功效。有文献报道甘草酸单铵盐对大鼠的炎性因子TNF-α及前列腺素具有明显的抑制作用，可降低关节液中TNF-α的生成来抑制炎症的反应，防止破骨细胞生成，从而减少骨浸蚀和骨破坏，降低骨质疏松的发病率[7-8]。Simmler等[9]认为甘草黄酮的生物活性主要来自于下调细胞内活性氧的能力，结合抗氧化效应，并作用于雌激素受体，可能作为一种选择性的植物雌激素受体调节剂来防止骨的破坏。Choi[10]研究表明，甘草黄酮可降低因线粒体功能障碍引起的老化，并能防止骨质疏松患者的成骨细胞的损伤，这可能与甘草黄酮诱导、激活的磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)和cAMP反应元件结合蛋白(CREB)细胞保护反应通路有关。Zhu等[11]也证实异甘草素(ISL)能够抑制核因子-受体激动剂配体(RANKL)诱导的通过RANK-TRAF6、MAPK、 AP-通路介导的破骨细胞形成和炎症性的骨损失。这些研究均表明甘草可防止骨破坏，可能是由于甘草通过影响了骨的生长、代谢免疫因子调节机制而起作用的。

骨组织形态计量学是70年代发展的，通过不脱钙骨的切片在显微镜下对骨组织进行定量分析的一种方法[12]。它是在二维的骨组织切片图像上，利用体视学方法，推导出反映骨重建、骨结构的三维参数，骨小梁间距、骨小梁厚度、体密度、皮质骨厚、面密度、骨小梁的弥散度等，并且能够分析类骨质，计算类骨质体积、平均骨壁厚等指标，获取骨细胞水平上的信息。骨组织形态计量学是一种直接研究骨组织本身，观察骨内变化的组织定量分析方法，对于骨的显微结构，尤其对骨小梁网状系统、骨基质结构、骨表面、骨间质和骨转换均可进行精确描述，有助于揭示骨的生理与病理改变的功能。功能的改变会影响形态学结构，所以从骨组织面积、骨小梁面积、骨小梁周长、骨小梁分离度、骨小梁数量、骨小梁厚度等形态计量学指标进行研究具有重要的意义。

本实验研究结果显示，去势组仅骨小梁结构少量表达；甘草汤低剂量组骨小梁组织表达相对增强，骨小梁数量增多、相对体积增大、分离度减小；甘草汤高剂量组骨小梁组织表达明显增强，骨小梁数量、相对体积进一步增大而分离度显著减小。甘草汤高、低剂量组骨小梁组织阳性目标总面积、骨小梁总周长及骨小梁数量均明显高于去势组，骨小梁分离度明显低于去势组。提示甘草汤可以通过增加成骨细胞中骨小梁的数量保护骨组织，增加骨量,并能防止骨基质的丢失,从而增加骨的韧性，可用于绝经后骨质疏松症的治疗。但是，甘草汤具体通过何种机制和途径作用于骨细胞重建来达到防治绝经后骨质疏松症，尚有待于进一步研究，这也是本课题组下一步的研究目标与方向。

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Experimental study of glycyrrhiza on the bone histomorphometry in ovariectomized osteoporotic rats

XU Taotao，LIU Renbin, CHEN Feng, ZHAO Guangheng, LI Chenggang

(Shiyan People's Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, Hubei, China)

Abstract:Objective It is to investigate the effects of glycyrrhiza on the bone histomorphometry in ovariectomized osteoporotic rats, and explore the intervention mechanism of osteoporosis, so as to provide experimental basis for clinical research. Methods The ovariectomized rat models of osteoporosis were established, 45 SD female rats were randomly divided into 3 groups, ovariectomized control group (A), short dose of glycyrrhiza group (B), high dose of glycyrrhiza group (C), 15 rats in each group. By corresponding method of intervention, the hismorphological structure of bone tissue sections were observed after staining by von kossa calcium staining, and the bone trabecula expression was detected by immunohistochemistry and image analysis technique. Results There was a little expression of trabecular bone structure in the ovariectomized control group (A);and the expression of the trabecular bone tissue, trabecula bone number, relative volume were increased,the degree of separation decreased in the short dose of glycyrrhiza group (B);and the expression of the trabecular bone tissue, trabecula bone number, relative volume were further increased and the degree of separation significantly decreased in high dose of glycyrrhiza group (C). Compared with the ovariectomized control group (A)，the trabecular bone area, trabecular bone perimeter, trabecular bone number, trabecular bone degree of separation all have a statistically significant difference(P<0.05 ). Conclusion Glycyrrhiza can protect bone tissue through raise bone cells and the bone trabecular number，prevent the loss of bone matrix, increasing the toughness of bone. Consequently glycyrrhiza has an distinct curative effect on osteoporosis.

Key words:glycyrrhiza; ovariectomized rats; osteoporosis; bone histomorphometry

[作者简介]徐桃桃，女，硕士，主治医师，主要从事骨科疾病及神经康复的科研及临床工作。 [通信作者]李成刚，E-mail：thxuefeng@126.com

[基金项目]湖北医药学院院级课题(B20112012)

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.10.006

[中图分类号]R-332

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)10-1044-04

[收稿日期]2015-10-20