冠心病“毒证”与传统外科“毒证”蛋白质组学差异研究

许京锋，尚青华，王　欣，徐　浩

冠心病“毒证”与传统外科“毒证”蛋白质组学差异研究

许京锋，尚青华，王欣，徐浩

中国中医科学院西苑医院(北京 100091)

摘要：目的 通过对中医传统“毒证”和冠心病(CHD)“毒证”的组间比较，探讨冠心病“毒证”的特异蛋白表达，为冠心病“毒证”理论的生物学基础提供依据。方法选择急性心肌梗死(AMI)、传统外科“毒证”病人各15例，采用Matrix Assisted Laser Desorption Ionization/Time-of-Flight Mass Spectroscopy(Maldi-Tof-MS)方法对两组人群血清蛋白进行比较分析和鉴定，最终确定CHD“毒证”和传统毒证的差异蛋白。结果共找到4个有明显统计学意义的蛋白多肽链，其中分子量为 2 022.61Da 的多肽链LOC653879(补体3类似物，Similar to Complement C3)组间差异最大，且能很好地将这两组区分；用QC方法建立的模型示该蛋白多肽链能够很好地与其他蛋白相结合，得到的识别率为 93.33%。结论补体C3类似物LOC653879是区别冠心病“毒证”与传统外科“毒证”的关键蛋白，值得进一步研究。

关键词：冠心病；毒证； 蛋白组学

“毒证”一般多见于温热病和外科痈疽疔疮，以红、肿、热、痛等为临床特点，在病理上常认为初起为温，温甚为热，热甚为火，火入血分则为毒，或初为湿盛，久郁化热，湿热酿毒。《毒证论》中将“毒证”的临床特征概括为：爆发性、剧烈性、危重性、传染性、难治性、顽固性，将“毒证”的病变特征归纳为：传递迅速、易于恶化、兼火兼热、夹瘀夹痰、入经入络、伤阴伤阳。张哲等[1]提出冠心病(CHD)的“脉瘤”“脉痈”理论，与外科“毒证”有相似之处；临床中也发现急性心肌梗死(AMI)具有起病急骤、传变迅速、病势凶险等特点，类似于CHD“毒证”；且越来越多的研究表明[2-6]，无论从临床症状还是从实验室指标上，解毒中药对急性冠脉综合征(ACS)均有明确疗效。但CHD“毒证”与传统“毒”中疮疡红肿热痛、舌质红绛等表象并不完全相符[7]，因此，CHD“毒证”与传统意义的“毒证”有何不同？是否有特异性的分子标记物？本研究即通过蛋白质组学方法比较中医传统外科“毒证”和CHD“毒证”的差异蛋白，探讨冠心病“毒证”的特异蛋白表达，以期为冠心病“毒证”理论的生物学基础提供依据。

1资料与方法

1．1诊断标准AMI的诊断标准，参照2001年中华医学会心血管分会“AMI诊断和治疗指南”中AMI的诊断标准[8]。外科“毒”的诊断标准，痈肿疮疖或急性扁桃体炎等具有典型红、肿、热、痛表现[9-10]。

1．2纳入标准AMI；年龄35岁～80岁。符合AMI诊断标准者，即具备下列三条标准中的两条：缺血性胸痛的临床病史；心电图的动态演变；心肌坏死的血清心肌标记物浓度的动态改变。中医传统“毒”证[11]：年龄18岁～80岁；皮肤、肌肉或脏器的痈疽疔疮以高热、红肿热痛或明确细菌感染性疾病的病人，如肠痈(急性阑尾炎)、乳痈(急性乳腺炎)、肺痈(急性肺炎)、肝痈(急性肝脓肿)、丹毒(急性蜂窝组织炎)等；体温≥37．5℃或白细胞总数>10×109/L且中性粒细胞百分比>70%。

1．3排除标准AMI；近1个月内有感染、发热、创伤、烧伤、手术史；严重心力衰竭，左室射血分数(LVEF)<35%者；恶性肿瘤；活动性风湿免疫性疾病、结核病；肝硬化、肾衰竭(Cr>2．0 mg/dL)或脏器移植者；严重慢阻肺，呼吸衰竭或肺心病、右心衰；严重血液系统疾病如白血病、再障；估计依从性较差或参加其他临床试验者。中医传统“毒”证，往有明确CHD病史者；痈疽疔疮已破溃，流脓已尽，属于愈合期者；肠痈、乳痈等已行手术治疗者。

1．4观察指标及血清多肽谱实验方法根据病例报告表详细记录各组一般资料、既往史、个人史、症状、体征、辨证分型等。信息采集、录入人员均为心血管科专科医师并接受过统一培训考核，所有录入信息由课题组主要研究人员进行核查确认后，方为有效。数据录入采用双人录入，确保资料的准确可靠。中医的辨证分型由两名副高以上中西医结合心血管医师确认。同时留取空腹血清-80℃冻存，用于最后统一的蛋白质组学检测。采用 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization/Time-of-Flight Mass Spectroscopy (Maldi-Tof-MS)方法对冠心病“毒证”和传统外科“毒证”两组人群的差异蛋白进行比较分析和鉴定，最终确定冠心病“毒证”的特异表达蛋白。采用 ClinProTool2．1 软件进行图谱分析和统计学处理，采用BioworksBrowser 3．3．1 SP1 进行 SequestTM检索， 检索数据库为 International Protein Index (IPI human v3．45 fasta with 71983 entries)。

2结果

2．1一般资料分析共入选中日友好医院急诊科冠心病“毒证”即AMI病人、中国中医科学院西苑医院外科中医传统“毒证”病人各15例。冠心病“毒证”15例，年龄(63．40±8．53)岁，男性9例(60．00%)，女性6例(40．00%)；15例传统外科“毒证”病人中，年龄(50．87±14．92)岁，男性11例(73．33%)，女性4例(26．67%)。年龄、 高血压病史、 脑卒中病史及心率有统计学意义 (P<0．05)，但考虑到疾病本身的特点，认为这符合真实世界的状态。详见表1。

表1　AMI组和传统外科“毒证”的基线资料

2．2AMI与传统外科“毒证”差异蛋白的多肽谱分析共找到4个有明显统计学意义的蛋白多肽链。详见表2。选择组间差异最大的蛋白多肽链进行鉴定，即分子量为2 022．61Da的多肽链。图1中可见分子量为2 022．61Da的蛋白多肽链两组间的峰值及峰面积差异显著；图2中可见CHD“毒证”组与传统外科“毒证”组比较所得到的差异蛋白多肽链能够很好地将这两组区分；用QC方法建立的模型，分子量为2 022．61的蛋白多肽链能够很好地与其他蛋白相结合，得到的识别率为93．33%。详见表2、图1、图2。

表2　CHD“毒证”与传统外科“毒证”差异蛋白多肽谱分析

注：实线为冠心病“毒证”；虚线为传统外科“毒证”。

图1分子量为2 022．61Da的蛋白峰分布

注：实线为CHD“毒证”；虚线为传统外科“毒证”。

图2分子量为2 022．61Da的蛋白多肽链判别两组样本的分布情况

2．3CHD“毒证”与传统外科“毒证”差异蛋白鉴定(见表3)

表3　CHD“毒证”与传统外科“毒证”相关蛋白鉴定

3讨论

本研究中CHD“毒证”组——AMI组补体C3 类似物LOC653879表达较高。补体C3作为天然的免疫分子，是人体最主要的补体成分之一，主要由肝脏和巨噬细胞合成，在补体C3转化酶的作用下，裂解成C3a和C3b两个片段，在人体补体经典激活途径和旁路激活途径中发挥着重要作用，也参与人体第三条补体激活途径——甘露聚糖结合凝集素途径的启动。通过EMBL-EBI中Uniprot查找该蛋白的主要功能包括：无论在经典激活途径还是在替代激活途径，都需要补体C3转化酶的参与，在这个过程中C3b通过活性硫酯的作用与细胞表面的碳水化合物结合形成免疫聚集物；C3a过敏毒素能够介导局部炎症反应，引起平滑肌收缩，增加血管的通透性，促进组胺的释放；酰化作用刺激蛋白也是补体C3裂解后的一条多肽链，与脂肪代谢有关，它能够刺激TG合成和脂肪细胞内葡萄糖的转运，调节脂肪的储存，对调节餐后TG水平起着重要作用，其促进TG合成的作用是通过激活PLC、丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen Activated Protein Kinase，MAPK)和 蛋白激酶AKT的信号传导途径来实现的。补体C3增高常见于某些急性炎症或者传染病早期，如急性肾小球肾炎、风湿热急性期、心肌炎、心肌梗死、关节炎等；降低常见于：① 补体合成能力下降，如慢性活动性肝炎、肝硬化、肝坏死等；② 补体消耗或者丢失过多，如活动性红斑狼疮、急性肾小球肾炎晚期、基底膜增生型肾小球肾炎、严重类风湿关节炎、冷球蛋白血症、大面积烧伤等；③ 补体合成原料不足，如儿童营养不良性疾病；④ 先天性补体缺乏，常可致严重感染等。

目前有研究表明补体C3与心肌损伤、血栓形成及CHD有关[12-14]；一项研究发现[15]，以C3为主的局部补体激活可以促进AMI病人血管的闭塞过程；近来又有报道认为，女性TG-C3组合升高提示抗炎能力和动脉保护功能的受损，可能预测糖尿病或者CHD的发生风险[16]。另外一项关于ACS病人HDL水平与炎症反应关系的研究发现[17]：ACS病人除了HDL的降低，还伴有明显的补体C3的升高。总之炎症反应贯穿于AS、CHD始终，与ACEs的发生密切相关，而CHD和ACEs病人补体C3水平增高可能与体内炎症-免疫机制激活有关。

在外科感染性疾病当中，马晓望等[18]的研究表明，外科局灶性感染组在感染早期、晚期C3值均无明显变化，但重症感染组的C3值却低于正常值，这说明当少量毒力的细菌侵入人体，机体只需启动体液内的免疫球蛋白及少量补体就可以防止感染扩散，但在重症感染时，由于大量抗原抗体复合物形成以及LPS的作用，消耗了大量的补体，同时，细菌毒素作用于机体导致各器官功能障碍，使补体合成不足，加上某些病人免疫力低下，造成补体C3水平下降。因此在炎症初期补体C3水平下降提示机体感染严重，病人免疫系统有不同程度的损害，如炎症后期C3水平仍较低，提示炎症向慢性过程发展，并有复发趋势。

由此可见，在AMI病人中，局部血管炎症可激活机体免疫功能，激活补体系统，导致补体C3水平升高；而在中医传统外科“毒证”病人中，补体消耗过量、生成不足，可造成补体C3的显著降低。补体C3类似物LOC653879可能是CHD“毒证”区别于传统外科“毒证”的生物标记物之一。

本研究初步筛选到区别CHD“毒证”和传统毒证的差异蛋白——补体C3类似物LOC653879。结合既往文献，该蛋白可能是区别两组人群的生物标记物之一，值得进一步研究。

参考文献：

[1]张哲，杨关林，张会永，等．以外科瘤痈论治动脉粥样硬化斑块设想探要[J]． 辽宁中医杂志，2008，35(2):201-202．

[2]杜武勋，刘长生，张红霞，等．热毒病机假说与急性心肌梗死发病机制的研究[J]．中西医结合心脑血管病杂志，2006，4(5):434-436．

[3]朱娜，曹雪明，蔡颖娴，等．黄连解毒汤对冠心病心绞痛患者C反应蛋白和肿瘤坏死因子-α的影响[J]．中国中医急诊，2012，21(4):542-543．

[4]郑峰，周明学，徐浩，等．活血解毒中药对稳定期冠心病患者血清炎症标记物及血脂的影响[J]．中华中医药杂志，2009，24(9):1153-1157．

[5]周明学，徐浩，陈可冀，等．几种活血解毒中药有效部位对ApoE基因敲除小鼠主动脉粥样斑块稳定性的影响[J]．中国病理生理杂志，2005，21(5): 864-867．

[6]邢晓博，马照琳，刘福颂，等．化浊解毒方联合西药治疗冠心病“易损血液”浊毒证临床观察[J]．成都中医药大学学报，2014，37(2):83-85．

[7]徐浩，史大卓，殷惠军，等． “瘀毒致变”与急性心血管事件：假说的提出与临床意义[J]．中国中西医结合杂志，2008，28(10):934-938．

[8]中华医学会心血管病分会，中华心血管病杂志编辑委员会，中国循环杂志编辑委员会．急性心肌梗死诊断和治疗指南[J]．中华心血管病杂志，2001， 29(12):710-725．

[9]中国中西医结合学会心血管分会．冠心病中医辨证标准[J]．中国中西医结合杂志，1991， 11(5): 257．

[10]中国中西医结合学会活血化瘀专业委员会．血瘀证诊断标准[J]．中西医结合杂志，1987，7(3): 129．

[11]付长庚，高铸烨，王培利，等．冠心病血瘀证诊断标准研究[J]．中国中西医结合杂志，2012，32(9):1285-1286．

[12]Pavlov VI， Skjoedt MO， Siow TY， etal． Endogenous and natural complement inhibitor attenuates myocardial injury and arterial thrombogenesis[J]． Circulation，2012，126(18): 2227-2235．

[13]Carter AM， Prasad UK， Grant PJ． Complement C3 and C-reactive protein in male survivors of myocardial infarction[J]． Atherosclerosis，2009，203(2): 538-543．

[14]Giasuddin AS， Elmahdawi JM， Elhassadi FM． Serum complement (C3， C4) levels in patients with acute myocardial infarction and angina pectoris[J]． Bangladesh Med Res Counc Bull，2007，33(3):98-102．

[15]Distelmaier K， Adlbrecht C， Jakowitsch J， et al． Local complement activation triggers neutrophil recruitment to the site of thrombus formation in acute myocardial infarction[J]． Thromb Haemost，2009，102(3):564-572．

[16]Onat A， Can G， Murat S， et al． Clinical biomarkers of high-density lipoprotein dysfunction among middle-aged Turks[J]． Anadolu Kardiyol Derg， 2012，12(8):628-636．

[17]Alwaili K， Bailey D， Awan Z， et al． The HDL proteome in acute coronary syndromes shifts to an inflammatory profile[J]． Biochim Biophys Acta，2012， 1821(3):405-415．

[18]马晓望， 李松香．外科感染疾病中免疫球蛋白和补体C3的变化[J]． 浙江医学，1997，19(2):121-122．

(本文编辑王雅洁)

Study on Specific Proteins Between Toxin Syndrome in Coronary Heart Disease and Traditional Toxin Syndrome in Surgical Diseases

Xu Jingfeng，Shang Qinghua，Wang Xin，Xu Hao

Xiyuan Hospital，China Acadeny of Chinese Medical Sciences，Bejing 100091，China Corresponding Author:Shang Qinghua

Abstract：ObjectiveTo find the specific proteins between toxin syndrome in coronary heart disease(CHD)and traditional toxin syndrome in surgical diseases．MethodsWe included 30 patients in 2 different groups including acute myocardial infarction(AMI) and traditional toxic syndrome(15 patients in each group).Matrix assisted laser desorption ionization/time-of-flight mass spectroscopy(Maldi-Tof-MS)technology was used to analyze and identify the differential proteins．ResultsFour peptides were found for distinguishing toxin syndrome in CHD and traditional toxin syndrome，peptides significantly higher expression in CHD toxin were 2 022.61Da(LOC653879，similar to complement C3)was identified，and it can distinguish the two group very well．Conclusion Similar to Complement C3 LOC653879 were identified as key protein distinguishing CHD blood-stasis toxin syndrome and traditional toxin syndrome，and it should be studied further．

Key words：coronary heart disease；toxin syndrome；proteomics

基金项目：973计划专项课题： 心血管血栓性疾病“瘀毒”病因学说的系统研究(No． 2006CB504803)，国家自然基金课题：基于蛋白质组学冠心病血瘀证瘀毒病机转变的生物学基础研究(No． 30973702)

通讯作者：尚青华，E-mail：qinghuashang@126.com

中图分类号：R541R256

文献标识码：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．01．002

文章编号：1672-1349(2016)01-0004-04

(收稿日期：2015-10-19)

·临床医学论著·