五倍子蜂蜜TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

孙 涛，夏明星，孔德英，张学健，滕少娜，邓朝晖，夏晓华，李应国＊

（1.重庆出入境检验检疫局，重庆400020；2.国家中药材物种鉴定及质量安全检测重点实验室，重庆400020；3.万州出入境检验检疫局，重庆404100；4.重庆峰谷美地生态养蜂有限公司，重庆404100）

五倍子蜂蜜TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

孙 涛1，2，夏明星3，孔德英1，2，张学健4，滕少娜1，2，邓朝晖1，2，夏晓华4，李应国3＊

（1.重庆出入境检验检疫局，重庆400020；2.国家中药材物种鉴定及质量安全检测重点实验室，重庆400020；3.万州出入境检验检疫局，重庆404100；4.重庆峰谷美地生态养蜂有限公司，重庆404100）

为五倍子蜂蜜的鉴定检测提供技术支撑，利用TaqMan探针实时荧光定量PCR技术，以五倍子树基因组中ITS基因为靶序列，设计并筛选出特异性引物探针，通过特异性、灵敏度和重复性等试验，建立五倍子蜂蜜TaqMan探针实时荧光PCR检测方法。结果表明：建立的方法特异性良好，生成的标准曲线有良好的线性关系，相关系数（R2）为0.998，最低检测限为0.2pg DNA／反应。该方法特异性强、灵敏度高、结果可靠。

五倍子树；蜂蜜；检测；TaqMan实时荧光定量PCR

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物结合经充分酿造而成的天然甜物质［1］。蜂蜜含有丰富的必需氨基酸、维生素、多酚类、类黄酮类、多糖、活性酶和类胡萝卜素等活性物质，具有多种生理功能，如抗氧化、抗菌、加速创伤修复和增强免疫等［2－3］。根据国际食品法典委员会蜂蜜标准、欧盟蜂蜜指令及其他相关规定，蜂蜜种类可按照来源、生产方式或外观划分［4－5］。一般是按照蜜蜂所采集的蜜源植物划分，主要蜜源是单一植物的称作单花种蜂蜜，采自多种植物的为杂花蜜或百花蜜。不同蜜源植物来源的蜂蜜成分主要取决于植物类型、花期、气候、蜂群强弱以及取蜜时间等，不仅在感官和内在品质上有一定差异，其营养效果也不同。传统方法难以辨别蜂蜜种类，容易造成蜂蜜市场价格混乱，且品种标识混淆［6］。因此，有必要开展蜂蜜种类鉴定研究。

五倍子蜂蜜是蜜蜂采自五倍子树的花粉酿制而成，为中药材蜜种，也是难得的森林蜜种，具有解毒、杀菌和止腹泻等作用，对肺肾双虚、脾肾虚寒、气促喘乏、痰火郁肺有良好辅疗效果，特别适合虚汗、肺虚、肾虚、久泻久痢、痔血和便血等人的日常食疗保健之用，市场需求量较大。五倍子蜂蜜市场售价是普通蜂蜜价格的3～5倍，市场上常出现廉价蜂蜜假冒五倍子蜂蜜的现象，极大地损害了消费者的利益，因此亟待建立切实可靠的五倍子蜂蜜鉴别技术。

近年来，实时荧光定量PCR技术以其灵敏度高、速度快、特异性强的优点在基因表达水平分析、多态性研究、物种特异性检测等方面得到广泛应用［710］。TaqMan探针法［11－14］作为高度特异的实时荧光定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3′～5′外切核酸酶活性，切断位于2条引物之间仅与模板特异性结合的探针，产生荧光信号，仪器通过收集分析信号进行结果判定，其结果准确、分辨率更高。鉴于此，笔者利用TaqMan荧光探针技术，建立一种特异性检测五倍子蜂蜜蜜源成分的实时荧光PCR方法，旨在为五倍子蜂蜜的检测提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 蜂蜜与蜜源

成熟五倍子蜂蜜，由重庆蜂谷美地生态养蜂有限公司提供。蜜源植物为五倍子树、红麸杨、青麸杨和白背麸杨，由重庆市药用植物研究所提供。油菜蜜、枣花蜜、荆条蜜、益母草蜜、柑橘蜜和荔枝蜜，由重庆蜂谷美地生态养蜂有限公司提供。

1.2 引物与探针

从美国国立生物技术信息中心（NCBI）网站基因库（GenBank）下载盐肤木属所有物种的ITS基因序列，并进行同源性分析，用Primer Premier 5.0软件分析设计引物和探针，筛选得到针对五倍子树的特异性引物探针。正向引物RCF：5′－AAACCTG CCTAGCAGAACGA－3′，反向引物RCR：5′－TAA GATTTCCTTGGCGCAAT－3′，探针RCPRO：5′－ACACGTGYTGCGCTGGGCGTCGGTCGTA－3′，探针两端分别用FAM和TAMRA标记，引物和探针由上海生工生物合成及标记。

1.3 蜂蜜及蜜源植物样本DNA的提取

蜂蜜DNA提取：称取蜂蜜样品10g放入有磁力搅拌子的50mL小烧杯中，加灭菌双蒸水20mL，40℃恒温振荡20min，使蜂蜜样品和水充分混合均匀，转移至50mL离心管；12 000r／min离心10min，迅速倒掉上清液，保留沉淀；用去离子水2mL冲洗离心管管壁上的沉淀，转入2mL离心管中，12 000r／min离心10min，弃上清液，保留沉淀［15］。然后用磁珠法植物基因组DNA提取试剂盒提取DNA。

蜜源植物样本DNA提取：五倍子树、青麸杨、红麸杨的叶片DNA用磁珠法植物基因组DNA提取试剂盒提取。

1.4 五倍子蜂蜜TaqMan探针实时荧光定量PCR检测体系的建立

1.4.1 PCR反应 采用经过优化后的最佳反应体系和条件。总反应体系20μL：2×定量荧光PCR反应预混液（TaqMan Mix）10μL、上下游引物（10μmol／L）各0.4μL、TaqMan探针（10μmol／L）0.8μL、DNA 4μL、灭菌去离子水4.4μL。荧光定量PCR反应条件：95℃30s；95℃5s，60℃30s，40个循环。试验过程中观察PCR荧光扩增曲线，根据循环数（Ct）值进行结果判定。

1.4.2 特异性检测 以五倍子树近缘种及常见蜂蜜蜜源植物的DNA作为模板，包括五倍子树、白背麸杨、红麸杨、青麸杨、油菜、枣、荆条和益母草，以五倍子树的DNA为阳性对照，灭菌去离子水为空白对照，按照PCR反应的体系及条件进行实时荧光PCR反应，分析该方法的特异性。

1.4.3 灵敏度检测 用灭菌去离子水将提取的五倍子树基因组DNA（浓度为5×103pg／μL）10倍梯度稀释成7个浓度，分别为5×103～5×10－3pg／μL，取4μL作为模板按照PCR反应的方法进行灵敏度检测。

1.4.4 重复性试验 分别取上述稀释后的五倍子树基因组DNA作为模板，进行荧光定量PCR反应。在同一个试验中，每个浓度DNA做3次重复，以分析组内差异。再以相同DNA为模板，在不同时间段进行3次独立重复试验，以分析组间差异。通过计算变异系数验证该方法的稳定性。

1.4.5 标准曲线的建立 分别取上述稀释后的五倍子树基因组DNA作为模板，每个浓度重复3次试验，同时以灭菌去离子水为阴性对照。按照PCR反应的方法进行实时荧光PCR反应。经Stepone plus荧光定量PCR仪软件自动分析得到荧光定量PCR方法的标准曲线。

1.4.6 蜂蜜样本实测 为评价建立方法对蜂蜜样本检测的实用性，分别以五倍子蜂蜜、油菜蜜、枣花蜜、荆条蜜、益母草蜜、荔枝蜜和柑橘蜜的DNA为模板，按照PCR反应的方法进行实时荧光定量PCR反应。

2 结果与分析

2.1 特异性及灵敏度

从图1可知，TaqMan探针实时荧光定量PCR方法检测五倍子树、五倍子蜂蜜呈典型的阳性反应，Ct值分别为22.49、22.40和31.87、31.02，呈特异性S形荧光扩增曲线；检测白背麸杨、红麸杨、青麸杨、油菜、枣、荆条和益母草均为典型的阴性反应，未见特异性荧光扩增曲线，均无荧光值增长。表明，所建立的五倍子TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法具有较强的特异性。

TaqMan探针实时荧光定量PCR方法具有较佳的线性检测范围，当DNA浓度为0.05pg／μL时，仍能够获得强的荧光信号，产生良好的特异性荧光扩增曲线，故最低检测限是0.2pg DNA／反应。说明，该检测方法具有较高的灵敏度。

图1 TaqMan探针实时荧光定量PCR方法的特异性（左）及灵敏度（右）图谱Fig.1 Specificity（left）and Sensitivity（right）graph of the TaqMan real－time PCR assay

2.2 重复性

从表中看出，组内重复Ct值变异系数为0.33%～1.46%，组间变异系数为0.48%～ 3.53%，均在合理范围。表明，建立的五倍子蜂蜜TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的稳定性良好。

表TaqMan探针实时荧光定量PCR方法检测五倍子树的重复性结果Table Repetitive experimental results of the TaqMan real－time PCR assay for detecting nutgall tree

图2 TaqMan探针实时荧光定量PCR方法检测五倍子树的标准曲线Fig.2 Standard curve map of the TaqMan real－time PCR assay for detecting nutgall tree

2.3 标准曲线

从图2看出，标准曲线中Ct值和DNA浓度间呈良好的线性关系，实时荧光定量PCR检测五倍子DNA的线性范围是103～10－2，标准曲线的相关系数（R2）为0.998（y＝－3.747x＋29.482），扩增效率为84.876%。表明，建立的实时荧光定量PCR检测方法有6个数量级的线性检测范围，进一步说明该检测方法具有很高的灵敏度。

2.4 样品实测结果

对重庆峰谷美地生态养蜂有限公司五倍子蜂蜜生产基地的30份五倍子蜂蜜样品及市购的五倍子蜜、油菜蜜等进行实时荧光定量PCR检测。结果表明，所有五倍子蜂蜜检测结果均为阳性，油菜蜜、枣花蜜、荆条蜜、益母草蜜、荔枝蜜和柑橘蜜检测结果均为阴性（图3）。说明检测方法的准确度高。

图3 TaqMan探针实时荧光定量PCR方法对样品的实测结果Fig.3 Samples measured drawing of the TaqMan realtime PCR assay for sample detection

3 结论与讨论

目前，国内外对蜂蜜真伪的鉴别主要集中在淀粉类、糖类、代糖类等添加物上，即通过离子色谱法、稳定碳同位素比率法、液相色谱示差折光法等检测蜂蜜中碳－4－植物糖、淀粉糖等的含量，并已形成多种国家标准方法［16－17］。但是，对于蜜源成分的检测及研究较少。对蜂蜜蜜源成分的检测常用方法为蜂蜜中植物花粉含量的测定［18］，即通过显微镜观察蜂蜜中蜜源植物的花粉并计数，计算蜜源植物花粉数占总花粉数的比率来确定花粉含量及浓度。这种方法对生物分类学要求较高，必须先认识蜜源植物花粉，且费时费力，而且五倍子蜂蜜中植物花粉的含量及浓度并未收入GB／T 23194－2008蜂蜜中植物花粉的测定方法［18］标准中，不适用于五倍子蜂蜜的检测。

本研究通过分子生物学方法，利用TaqMan探针实时荧光定量PCR技术，选取五倍子树基因组中ITS序列较为保守的区域，设计针对五倍子树的特异性TaqMan引物探针，建立了五倍子树TaqMa探针实时荧光定量PCR检测方法，并成功应用于五倍子蜂蜜的快速检测。该方法对植物分类学要求不高，有分子生物学基础的人员均可进行检测操作，方法简便，特异性良好，生成的标准曲线有良好的线性关系，相关系数（R2）为0.998；灵敏度高，最低检测限为0.2pg DNA／反应。本方法解决了样品是否含有五倍子蜂蜜的问题，而对于是否是其纯蜂蜜需进一步研究。

［1］中华人民共和国卫生部.GB14963－2011食品安全国家标准蜂蜜［S］.北京：中国标准出版社，2011.

［2］史伯伦.蜂产品与人类健康［J］.蜜蜂杂志，2005（8）：11－13.

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［16］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB／T21533－2008蜂蜜中淀粉糖浆的测定离子色谱法［S］.北京：中国标准出版社，2008.

［17］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB／T18932.1－2002蜂蜜中碳－4植物糖含量测定方法稳定碳同位素比率法［S］.北京：中国标准出版社，2002.

［18］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB／T23194－2008蜂蜜中植物花粉的测定方法［S］.北京：中国标准出版社，2008.

（责任编辑：冯 卫）

Establishment of a TaqMan real－time PCR Assay for Detecting the Chinese Gall Honey

SUN Tao1，2，XIA Mingxing3，KONG Deying1，2，ZHANG Xuejian4，TENG Shaona1，2，DENG Zhaohui1，2，XIA Xiaohua4，LI Yingguo3＊

（1.Chongqing Entry－Exit Inspection and Quarantine Bureau of China，Chongqing400020；2.State Key Laboratory of Chinese Herbal Medicine Species Identification and Quality Safety Testing，Chongqing 400020；3.Wanzhou Entry－Exit Inspection and Quarantine Bureau of China，Chongqing 404100；4.Chongqing FOGO Ecological Apiarian Co.，LTD，Chongqing404100，China）

In order to provide technical support for identification test of the Chinese gall honey，the TaqMan real－time PCR technique was used to develop a assay for detecting the Chinese gall honey.Primers and probe were designed from the ITS gene of Nutgall Tree and its specificity，sensitivity and repeatability were test in the paper.Results：The TaqMan real－time PCR assay for detecting the Chinese gall honey has good specificity，high detection sensitivity and reliable results.The detection limit was 0.2pg DNA／reaction.A good linear correlation was demonstrated in the standard curve for the real－time PCR assay，the correlation coefficient was 0.998.

nutgall tree；honey；detection；TaqMan real－time PCR

Q754

A

1001－3601（2016）08－0329－0015－04

2015－12－15；2016－06－13修回

重庆市科技计划项目“秦巴山区特色蜂蜜（五倍子）基因真伪鉴别技术研究”（cstc2014yykfA80022）；国家质检总局科技计划项目“基于DNA条形码的三种重要炭疽菌快速检测技术研究”（2015IK336）

孙 涛（1985－），男，农艺师，从事植物检疫研究。E－mail：hisun1985＠126.com

＊通讯作者：李应国（1965－），男，研究员，从事动植物检疫研究。E－mail：ciqlyg＠163.com