奶牛生乳中洛菲不动杆菌的分离鉴定与耐药性分析

林　杰，王旭荣，王　磊，王海瑞，朱永刚，杨志强，李建喜，张景艳

(中国农业科学院 兰州畜牧与兽药研究所，甘肃省中兽药工程技术研究中心，兰州　730050)

奶牛生乳中洛菲不动杆菌的分离鉴定与耐药性分析

林杰，王旭荣，王磊，王海瑞，朱永刚，杨志强，李建喜，张景艳

(中国农业科学院 兰州畜牧与兽药研究所，甘肃省中兽药工程技术研究中心，兰州730050)

摘要对29份外观正常的奶牛生乳乳样进行乳品质分析和细菌学检测，利用16S rDNA序列分析鉴定乳样中分离的菌株，并进行14种药物的敏感性试验。结果表明，10份乳样有细菌检出，其中4份乳样中分离得到洛菲不动杆菌；药物敏感性结果表明，洛菲不动杆菌对复方新诺明具有较强的耐药性；乳品质分析结果表明，该4份乳样体细胞数(SCC)偏高，乳成分和部分理化性质与其他正常乳无明显区别。

关键词洛菲不动杆菌；鉴定；耐药性；乳品质

洛菲不动杆菌属于不动杆菌属，在自然界广泛分布，是重要的机会致病菌，且致病性较强，其致病的报道[1]多见于人医，如急性肠炎、呼吸道感染、败血症、脑膜炎、肺炎、肺脓肿、心内膜炎、生殖泌尿道感染、伤口及皮肤感染等。在人医领域，院内不动杆菌感染已经得到一定重视，并有相关的跟踪研究。在养殖业中，尽管已有洛菲不动杆菌引发畜禽感染的报道[2-3]，但并未引起相关人员的关注与重视。鉴于洛菲不动杆菌引起的感染一般较为严重，且容易获得耐药性，在养殖业中应该对洛菲不动杆菌给予一定关注。

该研究从西安某奶牛场的29份生乳乳样中分离得到4株洛菲不动杆菌，考虑到其分离率偏高，对该4株菌进行药物敏感性分析，并对该4份乳样的乳品质及部分理化性质与其他25份乳样进行分析比较。

1材料与方法

1.1材 料

1.1.1样品采集2015年4月于西安某奶牛场选择健康奶牛29头，乳房外观正常，弃去头3把奶后，乳头用碘伏和φ=75%酒精消毒，观察乳汁外观正常后，无菌收集4个乳区的混合乳样，密封并做好标记，于冷藏箱中带回实验室。

1.1.2主要试剂营养肉汤、血琼脂平板购自广东环凯微生物科技有限公司；革兰氏染液购自南京建成科技有限公司；Bacterial DNA Kit购自OMEGA BIO-TEK公司；16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit 购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司。

1.1.3主要仪器体细胞分析仪(FossomaticTMMinor )，乳成分分析仪(MikoScanTMFT 120)。

1.1.4药敏纸片种类及抗生素剂量美洛西林(75 μg)、哌拉西林(100 μg)、替卡西林(75 μg)、头孢吡肟(30 μg)、头孢噻肟(30 μg)、头孢曲松(30 μg)、亚胺培南(10 μg)、美罗培南(10 μg)、庆大霉素(10 μg)、阿米卡星(30 μg)、四环素(30 μg)、复方新诺明(1.25/23.75)、环丙沙星(5 μg)、左氧氟沙星(5 μg)均购自OXOID。

1.2方 法

1.2.1细菌分离与纯化将待检乳样摇匀，无菌操作，吸取10 μL乳汁均匀涂布于血琼脂平板上，分别在有氧、37 ℃恒温培养18～24 h，观察细菌生长情况。对培养18～24 h无细菌生长的血琼脂平板延长至48 h。挑取细菌单菌落进行涂片固定，革兰氏染色，镜检。根据染色结果，挑取典型单菌落纯化培养，细菌纯净后保存，备用。

1.2.216S rDNA序列分析将细菌接种于营养肉汤中，37 ℃培养24 h。按照试剂盒操作说明提取被检细菌的DNA，并以此DNA为模板，用16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit中的Forward Primer 和Reverse Primer 扩增16S rDNA片段。扩增片段送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，通过NCBI(http://ncbi.nlm.nih.gov/)在线BLAST软件对获取的序列进行搜索比对，并确定细菌种属。

1.2.3乳成分与理化性质分析应用统计分析软件 SAS V8分析比较含有洛菲不动杆菌的4份乳样和其他25份乳样中体细胞数、乳成分和部分理化性质的差异。

1.2.4药物敏感性分析参考《CLSI的抗菌药物敏感性试验执行标准2013》，采用Kirby-Bauer(K-B)纸片扩散法测定分离菌株对抗菌药物的敏感性。每株菌3个重复，用游标卡尺测量抑菌圈直径，取3个重复的平均值。参照美国临床实验室标准化协会(CLSI，2013)推荐的标准进行判定，按抑菌圈直径大小将细菌对药物的敏感性分为：耐药(R)、中度敏感(I)和高度敏感(S)。

2结果与分析

2.1细菌分离结果

被检乳样29份中有10份检出细菌，其中4份分离得到4株洛菲不动杆菌，在血平板上的菌落形态是：黄白色，表面光滑，圆形凸起，边缘整齐，染色镜检结果为革兰氏阴性球杆菌(图1)。

图1　革兰氏染色镜检(×100)

2.216S rDNA序列分析结果

以提取的细菌DNA为模板，用16S rDNA细菌鉴定PCR试剂盒扩增16S rDNA片段，片段长度略大于500 bp(图2)。序列比对结果表明，与洛菲不动杆菌(KR054982.1)相似度为99%，确定分离菌株为洛菲不动杆菌。

M. DL2000 DNA maker;L1～L4.菌株编号Strain number

图2分离菌的16S rDNA PCR扩增

Fig.2Products of 16S rDNA of isolates

2.3乳成分与理化性质分析结果

29份乳样体细胞数分布见图3，体细胞数小于2×105mL-1的乳样占样本量的58.62%；小于3×105mL-1的乳样占样本量的65.52%。含有洛菲不动杆菌的乳样中，1份体细胞数为2.62×105mL-1，其余3份乳样体细胞数变幅为3×105～4×105mL-1。统计结果表明(表1)，分离出洛菲不动杆菌的乳样的体细胞数明显高于其他乳样的平均水平；乳成分分析结果表明，总固形物、乳脂率偏低，但差异较小；理化性质分析结果差异不明显。

图3　体细胞数分布

2.4药敏试验结果

健康牛牛乳中分离得到的洛菲不动杆菌对抗生素的耐药性较低，仅对复方新诺明具有较强耐药性(图4)。

表1　乳成分与理化性质统计±s)

S.敏感　Sensitive; I.中度敏感　Intermediate; R.耐药　Resistant

3讨论与结论

不动杆菌是非发酵糖类、专性需氧、氧化酶阴性、无鞭毛、无芽胞、不运动的革兰氏阴性杆菌，其中鲍曼不动杆菌和洛菲不动杆菌是代表菌种，是重要的机会致病菌。洛菲不动杆菌不仅能引起多种院内感染，同样能够导致动物的不同感染。引起动物感染的报道涉及奶牛子宫内膜炎[2]、仔猪肺部感染、新生驹败血症[3]、马流产[4]、兔急性感染[5]、大鼠的胃炎、高位泌素血症[6]、蛙的传染性抽搐症[7]、鹦鹉的呼吸道感染[8]以及鸽子的关节炎[9]等，说明洛菲不动杆菌感染涉及大型家畜、啮齿类、两栖类以及禽类，其种属分布范围广，且引起的感染均较严重。本试验共29份乳样，有4份乳样分离得到洛菲不动杆菌，而奶牛乳房炎主要病原菌——大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及链球菌的分离率为0，表明乳样中洛菲不动杆菌的分离率较高，且引起体细胞数的升高，故可以推测，该菌有引起奶牛乳房炎的风险，应给予一定的关注。

生乳是从符合国家有关要求的奶畜乳房中挤出的无任何成分改变的常乳。中华人民共和国发布的“GB19301-2010 食品安全国家标准”对生乳中体细胞数未作出明确限定，通过咨询了解到，目前西北地区不同生乳收购站对生乳体细胞数要求不同，一般要求低于3×105mL-1或4×105mL-1，临床认为体细胞数大于4×105mL-1或5×105mL-1时，多判定为患有隐性乳房炎。本试验可以看出，若排除4份体细胞数大于4×105mL-1的乳样后，含有洛菲不动杆菌的乳样体细胞数明显高于试验中其他正常乳样体细胞数的平均值。所以，洛菲不动杆菌引起生乳体细胞数增高会影响生乳的质量，甚至影响其销售。

本次乳品质检测过程中分离的洛菲不动杆菌耐药性不高，对复方新诺明耐药，与已有多数报道结果一致[10-11]。部分医院内洛菲不动杆菌对青霉素、头孢类以及复方新诺明的耐药性基本达到50%以上，存在多重耐药现象，且耐药率上升较快，某医院报道[12]其多重耐药菌分离率经过2 a时间就从9.5%上升至23.2%。洛菲不动杆菌现已成为“超级耐药菌的潜在菌群”[13-14]。由于部分奶牛场存在抗生素滥用问题，国内需要对牛场内的洛菲不动杆菌进行必要的监测，并对其药物敏感性进行跟踪。

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Received 2015-12-18Returned2016-01-08

First authorLIN Jie,female,master student. Research area:prevention and control of animal disease. E-mail qielinjie2009@163.com

(责任编辑：顾玉兰Responsible editor:GU Yulan)

Identification and Drug-resistance Analysis ofAcinetobacterlwoffiiIsolated from Dairy Raw Milk

LIN Jie,WANG Xurong,WANG Lei,WANG Hairui,ZHU Yonggang,YANG Zhiqiang,LI Jianxi and ZHANG Jingyan

(Engineering&Technology Research Center of Traditional Chinese Veterinary Medicine of Gansu Province,Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Science of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou730050,China)

AbstractIn this study,29 samples of dairy raw milk milk with normal appearance were tested for the milk quality and the bacteriology inspection. The bacteria was isolated from the normal milk sample and identificated by the 16S rDNA sequence analysis,and then,the sensitivity test of 14 kinds of antibiotics was performed. The results showed that among 29 milk samples,10 milk samples contained bacteria,and Acinetobacter lwoffii was isolated from 4 milk samples. The sensitive of antibiotics test indicated that Acinetobacter lwoffii was resistant to cotrimoxazole. The milk composition showed that these 4 milk samples had higher somatic cell count(SCC)than the other samples,while the other composition and the physical and chemical properties were similar to other milk samples.

Key wordsAcinetobacter lwoffii; Identification; Drug-resistance; Milk quality

收稿日期：2015-12-18修回日期：2016-01-08

基金项目：“948”项目(2014-Z9)；国家奶牛产业技术体系(CARS-37-06)；公益性行业专项(20130304)。

通信作者：张景艳，女，助理研究员，研究方向为中兽医药学与免疫学。E-mail:ZWZh1223@126.com

中图分类号S852.61

文献标志码A

文章编号1004-1389(2016)06-0811-05

Foundation item“948” Project(No.2014-Z9); Dairy Industry Technology and Systems Projects (No.CARS-37-06); Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest (No.20130304). ZHANG Jingyan,female,assistant research fellow. Research area:Chinese veterinarian medicine and immunology.E-mail：ZWZh1223@126.com

网络出版日期：2016-06-01

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160601.0914.006.html

第一作者：林杰，女，硕士研究生，从事动物疾病预防与控制相关研究。E-mail：qielinjie2009@163.com