大麦SERK基因家族cDNA克隆及生物信息学分析

杨沙沙，李颖波，谭何新，郭桂梅，何 婷，陈志伟，刘成洪*，黄剑华*

（1上海海洋大学水产与生命学院，上海201306；2上海市农业科学院生物技术研究所，上海市农业遗传育种重点实验室，上海201106；3第二军医大学药学院，上海200433）



大麦SERK基因家族cDNA克隆及生物信息学分析

杨沙沙1，2，3，李颖波2，谭何新3，郭桂梅2，何 婷2，陈志伟2，刘成洪2*，黄剑华2*

（1上海海洋大学水产与生命学院，上海201306；2上海市农业科学院生物技术研究所，上海市农业遗传育种重点实验室，上海201106；3第二军医大学药学院，上海200433）

摘 要：通过对大麦体细胞胚胎发生受体类蛋白激酶SERK（Somatic embryogenesis receptor-like kinases）基因家族进行注释和基因克隆，得到3条大麦序列，即HvSERK1、HvSERK2和HvSERK3，其中基因HvSERK3与相应已有参考序列（Accession：AK374641）相比，编码氨基酸有所改变。生物信息学分析表明：3条大麦SERK基因都具有1 870 bp左右的开放阅读框，620 aa左右的氨基酸残基数，69 kD左右的相对分子质量大小，平均理论等电点5.5，说明SERK为酸性蛋白；大麦SERK蛋白具有强烈的亲水性，且存在N端信号肽和跨膜螺旋区，二级结构组件主要是环（loop）。本研究为进一步探讨大麦中SERK基因家族的功能奠定了基础。

关键词：大麦；SERK；注释；克隆；生物信息学分析

体细胞胚胎发生受体类蛋白激酶（Somatic embryogenesis receptor-like kinases，SERKs）广泛存在于植物体内，参与调节植物生长发育和各类胁迫响应过程［1］。有关SERK基因的功能已在模式植物拟南芥［2-8］和一些重要禾本科作物如水稻［9-11］、小麦［12］和玉米［13］中都有研究报道，但大麦中有关SERK基因家族的信息还有待研究。

大麦（Hordeum vulgare L.）是仅次于水稻、小麦和玉米的第四大谷类作物，普遍用作麦芽制造、啤酒酿造、饲料生产和食品加工，其适应性广泛，具有较强的耐旱、耐寒和耐盐特性，近年来已成为重要的遗传和生理模式作物［14］。因此，对大麦中的耐逆性相关的基因开展深入研究，将有助于揭示大麦对环境较强适应性的分子机制，为禾谷类作物的耐逆性育种研究提供基础。

在前期研究工作中，Gao等［15］利用Affymetrix基因芯片，对大麦盐胁迫响应基因的表达水平进行了转录谱分析，获得了3 326个差异表达基因，其中探针contig5422_at在大麦耐盐性较强的品种中检测到，注释为Brassinosteroid insensitive 1-associated receptor kinase 1 precursor，进一步序列比对分析确认该基因属于SERKs基因家族。本研究在此基础上对大麦中SERKs基因家族的cDNA进行了全长克隆、验证和生物信息学分析，以便进一步开展大麦中SERKs基因功能研究。

1　材料与方法

1.1材料

供试材料为大麦品种‘花30’，由上海市农业科学院生物技术研究所提供。

用湿润纱布包裹种子于28℃恒温条件下催芽，至种子露白后移种到营养土中，人工气候室中培养至两叶一心期时，取新鲜叶片液氮速冻于-70℃，用于总RNA提取。

1.2方法

1.2.1大麦SERK家族基因的注释及同源性分析

在PLEXdb网站（http://www.plexdb.org/modules/PD_probeset/annotation.php）中检索获得contig5422_ at探针序列；以contig5422_at探针序列为参照，利用大麦全基因组数据库IPK（http://webblast.ipk-gatersleben.de/barley/viroblast.php）进行BLAST分析［16］，Database设为“full length cDNA”；利用ClustalX2软件进行多序列比对并用GeneDoc软件对比对结果进行编辑，从而显示序列间相似性和特征性保守区段；利用MEGA 5.0软件，对部分禾本科植物的SERK家族基因及8个大麦序列构建系统进化树；禾本科植物SERK蛋白序列同源比对采用NCBI上的Blastp程序完成。

1.2.2总RNA提取和cDNA合成

利用TRNzol试剂（北京天根生化科技有限公司）提取大麦‘花30’叶片的总RNA；RNA质量检测采用0.8%琼脂糖凝胶电泳的方法，RNA浓度［C（μg/μL）= A260×40×稀释倍数/1 000］采用紫外分光光度计来测定；按照反转录试剂盒产品说明书进行反转录。

1.2.3基因克隆及测序验证

根据目标研究基因在GeneBank中已知的cDNA序列，利用Vector NTI软件设计特异性引物（表1），确保引物无回文结构（Palindromes）和重复序列（Repeats）等。以RNA反转录合成的cDNA为模板进行RT-PCR反应，用于扩增基因全长并测序验证。

表1　引物设计Table 1 Design of primers

1.2.4生物信息学分析

利用网站PredictProtein（https：//www.predictprotein.org/）在线预测SERK蛋白二级结构；其他所用生物信息学软件和网站参照参考文献［17］。

2　结果与分析

2.1大麦SERK家族基因的注释及同源性分析

在IPK数据库中比对后，得到8个与探针contig5422_at相似性较高的全长cDNA序列，即AK372118 （99%）、AK252995（83%）、AK374641（78%）、AK371411（68%）、AK251794（68%）、AK358689（68%）、AK363516（68%）和AK360261（69%）。其中前3个序列的同源性明显高于其他5个基因，且E-value值为0.0，本研究将这3个大麦序列分别暂命名为HvSERK1（AK372118）、HvSERK2（AK252995）和HvSERK3 （AK374641）。

图1　8个大麦氨基酸序列和5个拟南芥SERK蛋白序列的多重比对Fig.1 Multiple alignment of 8 barley amino acid sequences and 5 Arabidopsis SERK protein sequences

上述8个大麦氨基酸序列和5个拟南芥SERK蛋白序列（AtSERK1—5）的多重比对，结果显示（图1）：Leucine zipper结构域中，拟南芥AtSERK1—3和大麦HvSERK1—3都具有完整的“Leu-X6-Leu-X6-Leu-X6-Leu”共识序列，而拟南芥AtSERK4、AtSERK5和其他5个大麦序列只具有“Leu-X6-Leu-X6-Leu/Leu-X6-Leu”的不完整结构。除了5个大麦序列的LRR5结构域变化较大，所有参与比对的SERK序列LRR1—LRR5结构域都具有很高的一致性。SPP结构域是SERK蛋白区别于其他LRR-RLKⅡ成员的特征性结构域［18］，大麦HvSERK1—3和拟南芥AtSERK1—3都具有此结构域，而拟南芥AtSERK4、AtSERK5和其他5个大麦序列缺失，且5个大麦序列与其他所有SERK基因的同源性最低。

图2　大麦及其他禾本科植物SERK蛋白序列的NJ树Fig.2 NJ phylogenetic tree of SERK protein sequences in barley and other grasses

2.1.1禾本科植物SERK家族基因的进化树

为进一步确认大麦SERK基因家族成员和物种进化，该试验对常见禾本科植物水稻、小麦、玉米以及菠萝中的已知SERK蛋白［19］进行了多序列比对和系统进化树分析。

图2显示，整个进化树由2个进化分支构成：3个大麦SERK序列HvSERK1 （AK372118）、HvSERK2（AK252995）和HvSERK3（AK374641）与其他禾本科植物的SERK蛋白序列同位于1个分支，即分支Ⅰ。其中，禾本科植物的SERK又可分为3组：大麦HvSERK1与小麦TaSERK1、水稻OsSERK1、玉米ZmSERK1聚为一类，HvSERK1与TaSERK1同源性最高；大麦HvSERK2与小麦TaSERK2以及玉米ZmSERK2、ZmSERK3聚为一类，HvSERK2与TaSERK2同源性最高；大麦HvSERK3与水稻OsbiSERK1以及菠萝AcSERK1、AcSERK2和AcSERK3聚为一类，HvSERK3与OsbiSERK1同源性最高。分支Ⅱ中包含了其他的5个大麦序列（AK358689、AK363516、AK371411、AK360261和AK251794），与禾本科植物的SERK序列位于不同分支，遗传距离较远，可能属于其他类型的RLK基因。

2.1.2序列同源性分析

根据系统进化树结果，对分支Ⅰ中所有禾本科植物和大麦中的3个SERK蛋白序列进行了同源性比对（表2），结果表明：大麦HvSERK1蛋白与TaSERK1、OsSERK1和TaSERK2具有较高同源性，分别为98%、94%和92%；大麦HvSERK2蛋白与TaSERK2、OsSERK1和TaSERK1具有较高同源性，分别为99%、91%和91%；大麦HvSERK3蛋白与OsbiSERK1、AcSERK1具有较高同源性，分别为93%、91%。3条大麦SERK蛋白之间的同源性在87%—91%。

表2　大麦与其他禾本科植物SERK蛋白同源性比较Table 2 Homology comparison of SERK proteins in barley and other grasses

2.2大麦SERK基因克隆

通过PCR扩增后经测序验证得到了3条与预期片断大小（2 077 bp、1 929 bp和1 896 bp）一致的目的条带。使用Vector NTI Advance11软件包中的AlignX软件和NCBI中的BLAST程序对测序结果与已有参考序列的ORF区域及其翻译的氨基酸序列进行比对发现，与相应的已有参考序列（Accession：AK374641）相比，大麦HvSERK3基因的测序序列存在3个碱基位点（160、941和1113）的突变和3组密码子（TGC→CGC、TAC→TTC、CTT→CTC）的改变，其中密码子TGC→CGC和TAC→TTC分别导致了编码氨基酸的突变：半胱氨酸（C）→精氨酸（R），酪氨酸（Y）→苯丙氨酸（F），属于非同义突变（图3）。其他2个克隆序列与参考序列都是完全一致，未发现任何核苷酸和氨基酸的突变。

图3　大麦HvSERK3基因ORF区核苷酸及氨基酸序列Fig.3 Nucleotide sequence and amino acid sequence in ORF region of barley HvSERK3 gene

2.3大麦SERK蛋白序列理化参数的检索和分析

对大麦及模式植物拟南芥SERK蛋白序列的理化参数进行分析比较，结果显示（表3），大麦和拟南芥SERK基因的蛋白参数基本一致。理论等电点（pI）值均为5.5左右，所带氨基酸残基比例都是酸性大于碱性，表明SERK蛋白呈弱酸性。大麦和拟南芥SERK蛋白所含主要氨基酸中，Leu的含量始终最高（13.7%），亮氨酸（Leu）、甘氨酸（Gly）、缬氨酸（Val）和丝氨酸（Ser）等其次。不同的是，大麦和拟南芥SERK蛋白均为不稳定蛋白，除了大麦HvSERK1的不稳定系数小于40，为稳定蛋白。总平均疏水性均为负值，说明大麦和拟南芥SERK蛋白具有很强亲水性，均属于亲水性蛋白。

表3　SERK蛋白序列的理化参数分析Table 3 Analysis of SERK protein sequences’physicochemical parameters

2.4大麦SERK蛋白亲疏水性的预测和分析

蛋白质折叠过程中会形成疏水内核和亲水表面，其折叠情况和相应的亲疏水性序列谱（Profile）可以由ProtScale程序绘制完成［20］。大麦SERK蛋白亲疏水性预测结果显示（图4），分值（Score）越低，表明此区域亲水性越强；反之，疏水性则越强。HvSERK1蛋白在第255位氨基酸处具有最高分2.126，第399位氨基酸处具有最低分-2.089；HvSERK2在第23位具有的最高分2.142，第400位具有最低分-2.321；HvSERK3在第245位具有最高分值2.089，第393位具有最低分值-2.021；3条序列的亲水区域都要大于疏水区域，均为亲水性蛋白。对拟南芥SERK蛋白序列进行分析，结果与大麦SERK蛋白一致。结合上述ProtPram预测的结果可知，大麦SERK蛋白是亲水性蛋白，表现为亲水性。

图4　大麦SERK蛋白亲疏水性的预测Fig.4 Prediction of barley SERK proteins’hydrophobicity and hydrophilicity

2.5大麦SERK蛋白导肽的预测和分析

利用工具“TargetP 1.1 Server”在线预测大麦和拟南芥SERK蛋白序列，将置信区间设为0.95。结果显示（表4），HvSERK1、HvSERK2和HvSERK3三条大麦SERK蛋白的导肽预测可靠性分别为IV级、IV级、V级，HvSERK1可能具有分泌途径信号肽，且在蛋白序列第30位存在一个导肽分裂位点，无法确定HvSERK2、HvSERK3是否具有导肽，也未发现其导肽分裂位点。AtSERK1、AtSERK2、AtSERK3、AtSERK4 4条拟南芥SERK蛋白的导肽预测可靠性均为Ⅰ级，说明可靠性很大，很可能都具有分泌途径信号肽，且分别在蛋白序列第23位、第29位、第25位、第33位存在一个导肽分裂位点；AtSERK5蛋白的导肽预测可靠性为Ⅲ级，也可能具有分泌途径信号肽，且导肽分裂位点位于第24位氨基酸。

表4　SERK蛋白的导肽预测Table 4 Prediction of SERK proteins’leader peptide

2.6大麦SERK蛋白信号肽的预测和分析

信号肽（Signal peptide）是蛋白质肽链N端包含16—30个氨基酸的一段多肽，可以引导蛋白质跨膜转移到特定亚细胞结构或分泌到胞外［20］。为了验证和进一步确认上述导肽预测结果，利用SignalP 4.1 Server工具在线预测和分析大麦SERK蛋白信号肽（图5）。基于Y-max和S-mean值判定，3条大麦SERK蛋白N末端均存在信号肽：HvSERK1和HvSERK2剪切位点在第30位点和第31位点间，成熟蛋白启动（包括）的位点是31，信号肽区为前30个氨基酸；HvSERK3剪切位点在第22位点和第23位点间，成熟蛋白启动（包括）的位置是23，信号肽区为前22个氨基酸。对拟南芥SERK蛋白序列预测，也获得到相似结果：AtSERK1信号肽区为前27个氨基酸；AtSERK2信号肽区为前28个氨基酸；AtSERK3信号肽区为前26个氨基酸；AtSERK4信号肽区为前30个氨基酸；AtSERK5信号肽区为前25个氨基酸。基于S-mean和D值，进一步说明大麦SERK蛋白是分泌蛋白，可能被跨膜分泌到特定亚细胞结构或细胞外起作用。

图5　大麦SERK蛋白的信号肽预测分析Fig.5 Prediction and analysis of barley SERK proteins’signal peptide

2.7大麦SERK蛋白的跨膜区预测和分析

跨膜蛋白通过与胞外信号分子结合，从而转导胞外信号［20］。利用TMHMM服务器在线预测和分析大麦SERK蛋白的跨膜区（图6），结果表明：对于HvSERK1蛋白，跨膜螺旋（TMhelix）区预测位置位于243—265处的氨基酸残基处，构成了一个跨膜区；对于HvSERK2蛋白，跨膜螺旋（TMhelix）区预测位置位于10—32和244—266处的氨基酸残基处，构成了2个跨膜区；对于HvSERK3蛋白，跨膜螺旋（TMhelix）区预测位置位于237—259处的氨基酸残基处，构成了一个跨膜区。对拟南芥SERK蛋白的跨膜区进行分析，结果与大麦相似：除AtSERK1蛋白具有2个跨膜螺旋区外，AtSERK2、AtSERK3、AtSERK4和AtSERK5蛋白均具有一个跨膜螺旋区。因此可确定大麦SERK蛋白是一个跨膜蛋白，具有转导细胞信号的功能。

图6　大麦SERK蛋白的跨膜区预测Fig.6 Prediction of barley SERK proteins’membrane-spanning region

2.8大麦SERK蛋白二级结构的预测和分析

蛋白质二级结构（Secondary structure）组件包括α-螺旋（α-helix）、β-折叠（β-sheet）、无规则卷曲（coil）及模体（motif）等［20］。利用PredictProtein预测大麦SERK蛋白二级结构（表5），结果显示：环状结构（loop）是大麦SERK蛋白二级结构的主要组件；所含氨基酸残基中，暴露氨基酸和包埋氨基酸等此外全部的氨基酸的比例基本一致。对拟南芥SERK蛋白进行同样预测，结果与大麦SERK蛋白一致，即蛋白二级结构中都是富含环状结构（loop）。

表5　SERK蛋白的二级结构和溶剂可及性预测Table 5 Prediction of SERK proteins’secondary structure and solvent accessibility

2.9大麦SERK蛋白三级结构的预测和分析

2个或多个结构域组合并折叠成的三维结构，即蛋白质三级结构（Tertiary structure）［20］。利用Phyre2线串法预测蛋白质折叠，运算模式设为“Normal”，结果如图7所示。

图7　大麦SERK蛋白三维结构预测Fig.7 Prediction of barley SERK proteins’three-dimensional structure

利用基于PROCHECK程序的在线蛋白质结构检验工具“PDBsum Generate”，从多个角度对预测蛋白模型的健康度进行评估，得到Ramachandran图（图8）和G-Factors值。大麦HvSERK1、HvSERK2和HvSERK3蛋白氨基酸残基落在最佳区（红色）的比例为85.0%、86.8%和87.2%，小于90%，说明3条大麦SERK蛋白的空间构象需要进一步优化，并没有落在最有利区；但是最佳区和次允许区（棕色）的总比例均大于90%，说明3条大麦SERK蛋白具有相对合理的空间结构；大麦HvSERK2和HvSERK3不允许区（浅色）的比例分别为0.9%和0.4%（低于1%），大麦HvSERK1不允许区比例为1.3%（高于1%），说明HvSERK2和HvSERK3的蛋白结构模型稳定性较好，HvSERK1稳定性较差。3条大麦SERK蛋白的GFactors值分别为0.05、0.06和0.04，大于-0.5，说明它们的空间结构属于正常范围内，是常见结构。

图8　大麦SERK蛋白Ramachandran图Fig.8 Ramachandran map of barley SERK proteins

3　结论与讨论

该研究以自主育成的啤酒大麦品种‘花30’为材料，通过同源克隆方法获得了大麦SERK家族3个基因的cDNA全长序列，其中2个基因的cDNA全长序列与国际大麦测序联盟（IBSC）公布的序列完全一致，而另一个基因HvSERK3与相应已有参考序列（Accession：AK374641）对比，有3个核苷酸的非同义突变以及编码氨基酸的变化。推测该序列变化可能是与克隆所用大麦材料不同有关，是否有功能上的差别还有待于深入研究。

SERKs具有多重作用，且家族成员间同时存在功能冗余和分化的现象。如，在模式植物拟南芥中，At-SERK1和AtSERK2参与植物花粉发育过程［2-3］；AtSERK1、AtSERK3/BAK1和AtSERK4/BKK1参与植物BR信号通路［4，8］；AtSERK3/BAK1和AtSERK4/BKK1参与植物先天免疫反应［5，7］；AtSERK3/BAK1和AtSERK4/BKK1参与调节细胞死亡［4，6］。常见禾本科植物水稻的SERK基因家族中，只有OsSERK2基因参与水稻对白叶枯病［11］和稻瘟病［9-10］的免疫反应。本研究对大麦SERK家族基因的核苷酸及氨基酸序列的理化特征、结构特点和功能等预测和分析，其中可以发现大麦中的3个SERK基因在一些理化特征上仍然存在差别：如HvSERK1为稳定蛋白，而HvSERK2和HvSERK3为不稳定蛋白；HvSERK1和HvSERK3具有一个跨膜区域，HvSERK2具有2个跨膜区域等。大麦中这3个SERK基因在功能上，特别是对外界环境中生物胁迫和非生物胁迫响应是否存在差异，还有待于在本研究基础上展开深入研究。

参 考 文 献

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（责任编辑：程智强）

Cloning and bioinformatics analysis of SERK gene family in barley（Hordeum vulgare L.）

YANG Sha-sha1，2，3，LI Ying-bo2，TAN He-xin3，GUO Gui-mei2，HE Ting2，CHEN Zhi-wei2，LIU Cheng-hong2*，HUANG Jian-hua2*
（1College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2Shanghai Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding/Biotech Research Institute，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201106，China；3School of Pharmacy，Second Military Medical University，Shanghai 200433，China）

Abstract：By annotation and cloning of barley SERK gene family，three barley sequences（HvSERK1，HvSERK2 and HvSERK3）were obtained，and the alignment with the corresponding reference sequence（Accession：AK374641）showed that the HvSERK3 gene’s amino acid sequence somewhat varied.The bioinformatics analysis indicated that the 3 barley SERK genes have the open reading frame（ORF）of about 1 870 bp，the amino acid residues of some 620 aa and the molecular weight of approximately 69 kD，and their theoretic isoelectric point is averagely 5.5，showing that the SERK are acidic proteins；The SERK are high in hydrophilicity and have signal peptide at N-terminus and transmembrane helix region，and the predicted secondary structures are mainly “loop”.This research has laid the basis for further functional study of barley SERK gene family.

Key words：Barley（Hordeum vulgare L.）；SERK；Annotation；Cloning；Bioinformatics analysis

中图分类号：S512.3

文献标识码：A

文章编号：1000-3924（2016）03-005-09

DOI：10.15955/j.issn1000-3924.2016.03.02

收稿日期：2016-03-28

基金项目：上海市自然科学基金（15ZR1436600）；上海市种业发展项目［沪农科种字（2016）第1-1号］；大麦青稞产业技术体系（CARS-05）

作者简介：杨沙沙（1990—），女，在读硕士，研究方向：大麦分子育种。E-mail：ayxyss0915@163.com

*通信作者：黄剑华，E-mail：sw1@saas.sh.cn；刘成洪，E-mail：liuchenghong@saas.sh.cn