Bt抗虫基因导入上海主栽粳稻品种‘秀水134’的研究

林冬枝，董彦君

（上海师范大学生命与环境科学学院植物种质资源开发中心，上海师范大学遗传研究所，上海200234）



Bt抗虫基因导入上海主栽粳稻品种‘秀水134’的研究

林冬枝，董彦君*

（上海师范大学生命与环境科学学院植物种质资源开发中心，上海师范大学遗传研究所，上海200234）

摘 要：为培育适宜上海地区种植的转Bt基因抗虫粳型水稻品种，采用传统轮回育种与现代分子育种手段结合，将我国第一个通过安全评估的水稻品种‘华恢1号’中的Bt基因CrylAb/CrylAc转育到上海主栽粳稻品种‘秀水134’中，育成了回交3次自交7代（BC3F7）品系‘Bt秀水134’；该品系在生育期、形态、产量及品质上与‘秀水134’相近或略好，可作为后续抗虫育种材料，也可作为上海地区推广转基因抗虫粳稻的储备品种。

关键词：水稻；Bt基因；性状；分子育种

水稻是全球最重要的粮食作物之一，世界近半数人以稻米为主食。我国是世界上最大的产稻国，水稻产量占全球总产量的1/3［1］，因此水稻生产在我国国民经济中占有十分重要的位置。水稻是受虫害影响最为严重的农作物之一［2］。长期以来，危害我国水稻的主要害虫有螟虫（稻纵卷叶螟、二化螟、三化螟）和稻飞虱［3］，每年因虫害造成水稻产量损失约为10%［4］。化学防治一直是水稻生产上害虫防治的主要方法，但在减轻虫害、提高水稻产量的同时也产生了新的问题。化学杀虫剂的大量使用不仅造成了严重的环境污染、生态失衡，而且提高了生产成本，还有可能降低稻米品质，以及害虫本身产生抗药性等问题。我国南方水稻生长季节易发生虫害，在上海、浙江、江苏等粳稻种植地区更为严重。因此，在这些地区更需要培育具有抗虫效果的粳稻品种。

目前，抗虫水稻都是利用转基因技术将苏云金芽胞杆菌的杀虫蛋白基因（Bacillus thuringiensis，简称Bt）作为外源基因导入水稻获得的，对鳞翅目害虫（如稻纵卷叶螟、二化螟和三化螟等）具有良好的抗性［5］。虽然目前已发现了上百种Bt基因，但是仅有很少部分被导入水稻中进行抗虫性测定。转基因抗虫水稻最初常以CrylA类为主，如CrylAb、CrylAc、融合基因CrylAb/CrylAc等。目前，Bt抗虫水稻的研究已取得了实质性进展［4，6］。华中农业大学的科学家们已将人工改造合成的Bt杀虫蛋白融合基因CrylAb/CrylAc转入杂交水稻恢复系‘明恢63’，培育出抗虫水稻‘华恢1号’及其配组‘Bt汕优63’。2009年，‘华恢1号’和‘Bt汕优63’均获得我国农业部颁发的农业转基因生物生产应用安全证书，由此我国成为了世界上第三个批准Bt转基因水稻的国家。目前，这两个水稻品种仍是我国唯一获得转基因应用安全证书的水稻品种。能够获得安全证书标志着含有Bt融合基因CrylAb/CrylAc的水稻品种‘华恢1号’已具备了进行商业化生产的前提条件之一［4，7］。

转基因作物自1996年商业化以来，在世界范围内以每年10%的速度增加。在转基因水稻方面，自2000年以来，美国先后批准了6个抗除草剂和药用转基因水稻，伊朗批准了1个转基因抗虫水稻商品化种植［7］；加拿大、墨西哥、澳大利亚、哥伦比亚批准了转基因水稻进口，允许食用［7］。获得我国安全证书的‘华恢1号’和‘Bt汕优63’均为籼稻，只能适应我国南方杂交籼稻区种植，其食味品质并不符合南方粳稻种植区人们的口感要求，因此将来也难以在包括上海市在内的南方粳稻区大面积推广。目前，尚未培育出适应上海市及周边地区种植的高产优质抗虫粳型水稻的储备品种。本研究选取已通过国家安全评估的转Bt抗虫基因‘华恢1号’水稻和上海市主栽粳型水稻品种‘秀水134’为材料，采用传统杂交和回交育种法以及分子标记辅助筛选，将转基因‘华恢1号’水稻中的Bt抗虫基因导入到上海市主栽粳稻品种‘秀水134’中，以期育成适合在上海等南方粳稻区种植的含有Bt抗虫基因的粳稻新品种。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1供体材料

供体为含Bt基因（CrylAb/CrylAc）的水稻材料‘华恢1号’（原名TT51），由华中农业大学林拥军教授提供。

1.1.2受体材料

受体亲本为常规粳稻品种‘秀水134’（原名丙O6-134），是浙江省嘉兴市农业科学研究院、中国科学院遗传与发育生物学研究所、余姚市种子管理站等合作选育的中熟常规晚粳稻品种。该品种于2010年2月通过浙江省农作物品种审定委员会审定［8］，2011年3月通过上海市农作物品种审定委员会审定，目前是上海市主要栽培水稻品种之一［9-10］。

1.2方法

1.2.1研究技术路线

以抗虫转基因水稻材料‘华恢1号’为Bt基因供体材料，以‘秀水134’为受体轮回材料，进行杂交和连续回交，并通过自交来获得纯合Bt转基因株系。本研究对每个世代水稻植株进行Bt基因分子标记检测，然后得到纯合转基因株系。试验在上海师范大学植物园内进行。

1.2.2Bt基因分子标记检测

采用由CTAB法［11］基础上调整后的快速制备DNA方法［12］提取亲本以及各世代的水稻植株基因组DNA。PCR扩增采用25 μL反应体系：PCR缓冲液21.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 0.5 μL、10 μmol/L上下游引物各0.5 μL、5 U/mL Taq酶0.2 μL和20 ng模板DNA 2.0 μL。在Eppendorf PCR仪上进行扩增，检测Bt基因的分子标记引物（Bt-F：5’-ATGCAGAGAGCTTCAGAGAGTG-3’，Bt-L：5’-GGCGTTTCCCATAGTTCCATAG-3’）由上海生工生物工程技术服务公司合成。PCR反应程序：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，35个循环；72℃延伸10 min。PCR反应产物用2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，经溴化乙锭染色后在UVP凝胶成像仪上成像观察。

1.2.3农艺性状和稻米品质调查

2015年，对育成转基因水稻‘Bt秀水134’的生育期、有效穗、穗长、每穗粒数、结实率、千粒重、单株产量进行调查，重复3次，计算平均值，并根据国家农业部测定标准测定稻米各项指标。

2　结果与分析

2.1携带Bt抗虫基因的‘Bt秀水134’的育成

2010年5月从华中农业大学林拥军教授处引进‘华恢1号’种子，种植于上海师范大学植物园内，与‘秀水134’杂交获得21粒F1种子（图1）。同年冬季将F1植株种植温室内，与‘秀水134’回交，获得回交BC1F1种子57粒。2011年春，分别提取BC1F1植株幼苗DNA，检测出24棵含有Bt基因植株（图2），移栽于植物园内，选择与‘秀水134’抽穗接近的4棵植株与‘秀水134’继续回交，获得BC2F1种子37粒。同年冬季通过对幼苗的DNA检测，鉴定出含有Bt基因的BC2F1植株9株，然后选择性状与‘秀水134’接近的BC2F1植株（3株）再与‘秀水134’回交，获得BC3F1种子125粒。2012年春，对BC3F1水稻植株DNA检测，鉴定出63株含有Bt基因的BC3F1植株，选出7棵综合性状与‘秀水134’相仿的BC3F1植株，获得BC3F2代种子。同年冬季，通过对BC3F2幼苗DNA检测，得到性状与轮回亲本‘秀水134’相仿的携带Bt基因的BC3F2代植株36棵，收获BC3F3代种子；2013年春，在上海师范大学植物园内进行隔离种植加代，成熟后，结合DNA检测和稻米外观品质鉴定，选出综合性状与‘秀水134’相仿，含有纯合Bt基因的BC3F4代13个株系，然后冬季在温室内加代种植，获得BC3F5代种子；2014年春，将13个株系种植于上海师范大学植物园内，进行综合农艺性状与Bt基因鉴定，最终将编号BtR7的BC3F6株系命名为‘Bt秀水134’。

图1　‘Bt秀水134’选育过程Fig.1 Breeding process of‘Bt Xiushui 134’

图2　部分水稻植株Bt基因检测结果Fig.2 Detection results of Bt gene in some rice plants

2.2‘Bt秀水134’农艺性状

‘Bt秀水134’全生育期157 d左右，属中熟晚粳品种，感光性强。株高93 cm左右，生长整齐，茎秆粗壮，株型紧凑，叶鞘包节，耐肥抗倒力强。叶片挺直，叶色较绿，成熟期转色佳。穗直立，着粒较密，谷粒短圆，护颖、颖尖均为秆黄色，无芒，脱粒性中等。单株平均有效穗7.9个，每穗总粒数153粒左右，穗长14.6 cm左右，结实率高达94.8%左右，千粒重25.1 g，单株产量45.6 g。与轮回亲本‘秀水134’相比，‘Bt秀水134’单株穗数、千粒重和结实率略少，每穗粒数明显增多，其余农艺性状与其相仿（图3，表1）。

图3　‘Bt秀水134’和‘秀水134’的植株和米粒Fig.3 Plants and rice of‘Bt Xiushui 134’and‘Xiushui 134’

表1　‘Bt秀水134’农艺性状Table 1 Agronomic traits of‘Bt Xiushui 134’

2.3‘Bt秀水134’稻米品质

对2015年种植收获的‘Bt秀水134’稻谷检测表明，其糙米率85.1%，整精米率72.3%，长宽比1.7，垩白粒率21.3%，垩白度4.3%，胶稠度68.6 mm，直链淀粉含量17.2%，蛋白质含量9.2%。与轮回亲本‘秀水134’相比，除营养指标的蛋白质含量略少之外，其余均好于或者与‘秀水134’相仿（表2）。

表2　‘Bt秀水134’和‘秀水134’稻米品质比较Table 2 Comparison of rice quality of‘Bt Xiushui 134’and‘Xiushui 134’

3　结论与讨论

本研究通过传统轮回育种与现代分子育种手段相结合，将‘华恢1号’中Bt抗虫基因转育到上海市主栽水稻品种‘秀水134’中，育成了生育期、形态、产量及品质与‘秀水134’相近的新型粳稻新品系‘Bt秀水134’。‘Bt秀水134’的成功培育为今后在上海推广转基因抗虫粳稻提供了优良的储备品种。

Bt转基因水稻除了具有明显的抗虫效果，还具有以下优点：一是可节省成本投入，降低劳动强度，避免由此造成的农药中毒；二是可减少杀虫剂的用量，降低农药对田间益虫的负面影响，维持田间种群动态平衡；三是减少农药残留对生态环境的污染，降低农业污染的发生率［6-7］。目前，转基因水稻安全性受到广泛关注，外源基因在水稻中是否安全表达，除了外源基因本身是否表达有毒性蛋白外，其转入基因组位置也有可能破坏水稻基因自身正常表达，也有可能影响转基因水稻的安全性。也就是说，DNA序列相同的Bt抗虫基因由于插入水稻基因组不同位置有可能造成转基因水稻品种安全性不一致。

‘华恢1号’已通过国家严格安全评估试验，充分证实‘华恢1号’中的Bt抗虫基因在水稻中表达安全，不会对人体和生态环境产生不利影响，符合国家技术标准分析。鉴于上述原因，本研究育成的适应上海（南方粳稻区）种植的高产优质抗虫转基因粳稻品系‘Bt秀水134’更容易通过中间试验、环境释放以及生产性试验，更易获得农业部转基因安全证书。

致谢：感谢华中农业大学林拥军教授提供Bt抗虫水稻‘华恢1号’材料以及在本实验室攻读学位的江泉、巩孝帝、江少华、吴军、梅杰、刘艳霞、朱环环、潘倩文、郑凯伦、王文娟、雷晓庆、吴兰兰、王妍斌等同学对研究的支持。

参 考 文 献

［1］MACLEAN J L，DAWE D C，HARDY B，等.水稻知识大全［M］.福州：福建科学技术出版社，2003.

［2］王丽冰，刘立军，颜亨梅.转Bt抗虫基因水稻的研究进展和生物安全性及其对策［J］.生命科学研究，2009，13（2）：182-188.

［3］ZHANG Q.Strategies for developing green super rice［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（42）：16402-16409.

［4］CHEN H，LIN Y，ZHANG Q F.Review and prospect of trans-genic rice research［J］.Chinese Science Bulletin，2009，54：4049-4068.

［5］李金军，徐美玲，富昊伟，等.转基因水稻在回交一代的抗虫性表现［J］.浙江农业科学，2000（6）：267-268.

［6］张丽萍，查仁明，李尚伟.转Bt基因抗虫水稻的研究进展［J］天津农业科学2012，18（6）：9-13.

［7］中国农科院生物技术专家林敏就转基因安全问题答记者问［EB/OL］.［2010-07-20］http://www.moa.gov.cn/ztzl/zjyqwgz/zxjz/201007/t20100720_1602120.htm.

［8］李老虎，严冬晖.晚粳稻新品种秀水134的特征特性及高产栽培技术［J］.现代农业科技，2010（6）：84-87.

［9］胡大明，蒋其根，郑超，等.水稻新品种秀水134特征特性及高产栽培技术［J］.上海农业科技，2011（6）：29-30.

［10］周金玉，姚全甫.秀水134的特性及高产栽培技术［J］.中国稻米，2012（3）：78-79.

［11］MURRAY M G，THOMPSON W F.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA［J］.Nucleic Acids Res，1980，19：4321-4325.

［12］王兰，龙云铭，刘耀光.一种用于PCR的植物基因组DNA快速制备方法［J］.分子植物育种，2009，2（7）：425-428.

（责任编辑：闫其涛）

Study on transfer of Bt gene with pest-resistance into a leading japonica variety‘Xiushui 134’of Shanghai area

LIN Dong-zhi，DONG Yan-jun*
（Development Center of Plant Germplasm Resources，College of Life and Environmental Sciences，Shanghai Normal University；Institute of Genetics，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China）

Abstract：In order to breed trans-Bt japonica rice varieties suitable for planting in Shanghai area，Bt gene （CrylAb/CrylAc）of‘Huahui 1’which was the first rice variety passing safety assessment in China was transferred into japonica rice variety‘Xiushui 134’mainly cultivated in Shanghai by traditional recurrent breeding and modern molecular breeding，and the BC3F7line‘Bt Xiushui 134’was bred.The line was similar to or slightly better than‘Xiushui 134’in growth period，shape，yield and quality.It could be used as a breeding material for insect resistance，and also could be used as a reserve variety of transgenic insect resistant japonica rice in Shanghai area.

Key words：Rice；Bt gene；Character；Molecular breeding

中图分类号：S511.035

文献标识码：A

文章编号：1000-3924（2016）03-001-04 D

DOI：10.15955/j.issn1000-3924.2016.03.01

收稿日期：2016-02-17

基金项目：国家自然科学基金项目（30971552）；上海市自然科学基金项目（16ZR1425300）；上海师范大学项目（SK20159）

作者简介：林冬枝（1971—），女，博士，副教授，研究方向为水稻分子生物学

*通信作者，E-mail：dong@shnu.edu.cn