Calpain-1及Calpain-2在不同迁移能力肝癌细胞系中的表达*

王　宁， 陈腾祥， 刘振华， 王飞清， 潘　娅

(1.贵州省骨科医院 药剂科， 贵州 贵阳　550002； 2.贵州医科大学 生理教研室， 贵州 贵阳　500004； 3.贵州省人民医院 肝胆外科， 贵州 贵阳　550001； 4.贵州省中医院 检验科， 贵州 贵阳　550001)

Calpain-1及Calpain-2在不同迁移能力肝癌细胞系中的表达*

王宁1**， 陈腾祥2***， 刘振华3， 王飞清4， 潘娅2***

(1.贵州省骨科医院 药剂科， 贵州 贵阳550002； 2.贵州医科大学 生理教研室， 贵州 贵阳500004； 3.贵州省人民医院 肝胆外科， 贵州 贵阳550001； 4.贵州省中医院 检验科， 贵州 贵阳550001)

[摘要]目的： 研究钙激活中性蛋白酶蛋白-1(Calpain-1)及Calpain-2在不同迁移能力肝癌细胞系中的表达。方法： 常规细胞培养高迁移能力的MHCC97-H、低迁移能力的MHCC97-L、无迁移能力的HepG2的人肝癌细胞及正常人肝HL-7702细胞，采用western-bolt方法观察Calpain-1及Calpain-2在3株人肝癌细胞及正常肝细胞中的表达。结果： Calpain-1在正常肝细胞HL-7702、高迁移能力的MHCC97-H、低迁移能力的MHCC97-L及无迁移能力的HepG2细胞中均有表达，表达量差异无统计学意义，P>0.05；与正常肝细胞HL-7702比较，高、低、迁移能力肝癌细胞系中Calpain-2不同程度表达，随着细胞迁移能力增强而成递增趋势，P<0.01或P<0.05。结论： Calpain-2随肝癌细胞迁移能力的增强表达增加，表明Calpain-2与肝癌细胞的侵袭转移可能有密切关系。

[关键词]癌，肝细胞； 钙激活中性蛋白酶蛋白； 迁移能力

原发性肝癌(primary hepatocellular carcinoma,PHC)目前在我国的死亡率高居癌症的第2位，据相关文献调查其患病率约占全球癌症患病率的55%[1-2]。研究发现，组织中的钙激活中性蛋白酶(calcium activated neutral protease,Calpain)对某些肿瘤细胞的迁移能力有明显影响[3]，这在防治肝癌转移靶点研究中报道甚少。本研究选择不同转移能力的肝癌细胞MHCC97-H、MHCC97-L、HepG2和正常肝细胞HL-7702作为研究对象，通过Western Blot研究Calpain家族中Calpain-1和Calpain-2蛋白在肝癌患者发生癌细胞转移中的表达情况，为临床治疗肝癌发生癌细胞转移提供新的治疗靶点和基础数据。

1材料与方法

1.1材料试剂与仪器

人肝癌细胞系MHCC97-H、MHCC97-L、HepG2和正常人肝细胞HL-7702均由中国科学院上海生命科学院细胞库提供，DMEM培养基(Hyclone公司)，胎牛血清(FBS)，原装引进USA Cell Signaling Technology(Calpain-1、2的一抗、羊抗兔二抗血清)，原装引进USA Merck Millipore PVDF转化膜，Thermo Scientific CO2培养箱，实验通用蛋白定量试剂盒(BCA)、碧云天生物技术公司产蛋白质上样缓冲液，Beckman Coulter产实验专用高速冷冻离心机， Syngene 产GBOX iChemiXR化学发光及凝胶成像仪，北京六一公司产垂直型蛋白电泳系统和电泳仪。

1.2方法

1.2.1细胞的培养与处理人肝癌细胞系MHCC97-H、MHCC97-L、HepG2和正常肝细胞HL-7702细胞为贴壁生长，用DMEM培养基+10% FBS(胎牛血清)，放置在37 ℃，5% CO2孵箱环境中培养。当培养生长的癌细胞密度为80%左右时，对癌细胞进行计数，将癌细胞传代与标记皿中继续培养，在冰上用RIPA裂解液裂解培养已伸展完全的癌细胞，低温高速离心细胞液取上清液制备蛋白样品。

1.2.2免疫印记实验 依据蛋白定量试剂盒实验步骤，对样品蛋白进行定量，实验样本化学发光显色，用免疫印记实验凝胶成像仪对已显色的样本成像显示Calpain-1及Calpain-2 含量和磷酸化情况分析。

2结果

2.1Calpain-1表达

Western blot检测发现，不同转移能力的人肝癌细胞(MHCC97-H、MHCC97-L、HepG2)中Calpain-1蛋白表达，与正常人肝细胞HL-7702相比，Calpain-1的表达变化不明显，P>0.05。见图1。

2.2Calpian-2表达

如图2所示，Calpain-2在3种肝癌细胞中的表达量明显高于正常肝细胞HL-7702 。与正常肝细胞HL-7702比较，高转移肝癌细胞MHCC97-H中 Calpain-2的表达增高明显，P<0.01，其低分子量(low molecular weight,LMW)剪切片段形式显著增多，可见Calpain-2被剪切有至少6种LMW片段；在低转移肝癌细胞MHCC97-L中，Calpain-2的表达异常，P<0.01，Calpain-2也可被剪切2种LWM片段；不转移的肝癌细胞(HepG2)Calpain-2的表达比HL-7702高，P<0.05。

注：A为Western blot结果，B为A的统计结果(1)P<0.05，(2)P<0.01 vs Control图2　MHCC97-H、MHCC97-L、HepG2和HL-7702中Calpain-2的表达Fig.2　Expressions of Calpain-1 in MHCC97-H,MHCC97-L, HepG2 and, HL-7702

3讨论

肿瘤发生发展是多因素、多基因、多阶段才最终形成的十分复杂的生物学现象，具有细胞黏附、基质降解、细胞运动3个最基本步骤。Calpain是钙蛋白Cal(Calmoclulin)和木瓜蛋白酶pain(Papain)两者以非共价键结合形成。Calpain有多种同工酶，按照其分布特点可将其分为两大类，一类具有组织特异性，另一类非组织特异性蛋白酶[4]。近年来，非组织特异性蛋白酶的研究比较深入，其已知的2种亚型是Calpain-1(也称μ-calpain)和Calpain-2(也称m-calpain)，它们的激活需要不同浓度的钙离子水平，在不同的生理或病理状态下，Calpain-1或Calpain-2的生物学作用也不同[5]，在很多应激的情况下，Calpain家族蛋白的表达和活性都会发生相应的变化，而这些活性的变化与细胞周期、细胞信号转导及细胞增殖、分化及细胞凋亡[6]、细胞骨架重塑与迁移有着密切的关系，在癌细胞中，这种明显异常的变化，提示Calapin家族蛋白参与了癌细胞的恶性演变，研究认为Calpain与细胞的迁移浸润有关[7-8]。已有研究发现乳腺癌或前列腺癌细胞中，Calpain-2可以直接使细胞迁移方向的后方细胞皮质的丝状肌(filamentousactin，F-actin)解体[9]。相关文献前期研究报道，癌细胞胞内钙离子浓度在恶性肿瘤细胞中的含量表现明显的升高，其细胞的离子内环境平衡状态发生紊乱，实验研究提示肝癌细胞中的Calpain 发挥功能机制作用可能是在高浓度Ca2+的环境下[10]。肿瘤的侵袭和转移是导致肿瘤治疗效果不佳和患者最终出现死亡的重要原因之一，也是极为复杂、多分子水平改变、涉及多基因的过程，大约有细胞异常的增殖、肿瘤细胞从原发灶上脱落、侵犯组织血管或淋巴管、迁移，黏附着于远处管腔床、侵入靶器官和远处部位形成继发肿瘤等表现[11]。而在以人纤维肉瘤细胞、胶质母细胞瘤细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞等癌细胞为基础的实验研究报道中，认为Calpain-2可以作为抑制肿瘤侵袭转移的一个潜在靶点[12-16]。

本研究发现在肝癌细胞MHCC97-H、MHCC97-L、HepG2中Calpain的家族成员Calpain-2的表达显著增多，尤其是在高转移能力的肝癌细胞MHCC97-H中，calpain-2的蛋白表达最高，且随着肝癌细胞迁移能力的增强，calipain-2的蛋白表达也呈现递增现象，这一实验结果提示Calpain-2在肝癌细胞的侵袭和迁移能力中发挥作用。

综上所述，Calpain-2在3种肝癌细胞(无、低、高迁移能力)中的表达随迁移能力的增强而增加，表明Calpain-2可能与肝癌的转移、复发密切相关，其可能成为评价肝癌生物学行为的重要指标之一。Calpain-2有望成为肝细胞癌临床靶向治疗的新靶点，但其具体的作用机制还有待进一步研究。

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(2016-03-12收稿，2016-05-28修回)

中文编辑： 潘娅； 英文编辑： 刘华

Expression of Calpain 1 and 2 in Liver Cancer Cells with Different Migration Abilities

WANG Ning1, CHEN Tengxiang2, LIU Zhenhua3, WANG Feiqing4, PAN Ya2

(1.DepartmentofPharmaceuticalPreparation,GuizhouProvinceOstelolgicalHospital,Guiyang550002,Guizhou,China;2.DepartmentofPhysiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.DepatmentofLiverandGallSurgery,GuizhouProvincialPeople'sHospital,Guiyang550002,Guizhou,China; 4.ClinicalLaboratory,GuizhouProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Guiyang550001,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate protein expression of Calpain-1 and Calpain-2 in liver cancer cell line with different migration ability. Methods: MHCC97-H (highly migratory liver cancer cells), MHCC97-L (lowly migratory liver cancer cells), HepG2 (liver cancer cells with no migration ability) and HL-7702 (normal liver cells) were routinely cultured. Western-blot method was used to observe protein expression of Calpain-1 and Calpain-2 in the three human liver cancer cell lines and the normal liver cell. Results: There were protein expressions of Calpain-1 in HL-7702, MHCC97-H, MHCC97-L and HepG2, and the difference was not statistically significant (P<0.05). Compared with normal liver cells HL-7702, Calpain-2 showed the different degrees of protein expression in high, low, migration ability of liver cancer cell line , and the protein expression of Calpain-2 significantly enhanced with increasing cell migration ability (P<0.01 or P<0.05). Conclusions: Calpain-2 shows an increasing protein expression with the enhancement of the migration ability of liver cancer cells, which indicates that calpain-2 may be closely related to the invasion and metastasis of liver cancer cells.

[Key words]carcinoma,hepatocellular; Calpain; migration ability

*[基金项目]贵州省科技厅科研基金[黔科合LG字(2011)008]; 贵州省教育厅自然科学研究项目[黔教科(2008)022]

[中图分类号]R735.7

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2016)06-0649-04

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.06.007

**贵州医科大学2014届硕士研究生

***通信作者 E-mail:710232517@qq.com；371251826@qq.com

网络出版时间：2016-06-16网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160616.1742.058.html