[Na2(H2O)10][Cu4(H2O)12(H2W12O42)]·15H2O抑制人宫颈癌Hela细胞增殖的研究

曲小姝，刘树萍，宁　波，杨艳艳

(1.吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林 吉林 132022；2.哈尔滨商业大学旅游与烹饪学院，黑龙江 哈尔滨 150076；3.长春职业技术学院食品与生物技术学院，吉林 长春 130021)

[Na2(H2O)10][Cu4(H2O)12(H2W12O42)]·15H2O抑制人宫颈癌Hela细胞增殖的研究

曲小姝1，刘树萍2，宁波3，杨艳艳1

(1.吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林 吉林 132022；2.哈尔滨商业大学旅游与烹饪学院，黑龙江 哈尔滨 150076；3.长春职业技术学院食品与生物技术学院，吉林 长春 130021)

[摘要]研究了过渡金属铜修饰的仲钨酸盐化合物[Na2(H2O)10][Cu4(H2O)12(H2W12O42)]·15H2O(Na2Cu4W12)的体外抗肿瘤活性.取人宫颈癌细胞Hela加入不同浓度Na2Cu4W12处理，应用MTT法分析细胞增殖，计算了半数抑制浓度(IC50)；采用光学显微镜观察Hela细胞的凋亡形态变化；用流式细胞术分析细胞周期和细胞凋亡，计算了各期细胞比例及细胞凋亡率.结果表明：Na2Cu4W12对Hela细胞增殖抑制的IC50值为10.2 μmol/L，且呈剂量依赖性；光学显微镜下可观察到Na2Cu4W12处理组细胞数目明显减少，出现变圆、缩小、老化等形态变化；不同浓度Na2Cu4W12处理12 h后，早期凋亡细胞所占的百分比显著增加且呈剂量依赖性.

[关键词][Na2(H2O)10][Cu4(H2O)12(H2W12O42)]·15H2O；人宫颈癌细胞Hela；抗肿瘤；体外研究

0引言

恶性肿瘤是当今世界危害人类生命健康的一种重大疾病，其发病率逐年增长，目前临床使用的多数抗肿瘤化学药物有效率低、选择性差、毒副反应大及肿瘤细胞耐药等缺点.世界科研机构和制药公司纷纷投入大量的人力、物力进行抗癌新药研发，因此，研究开发高效、低毒，具有我国自主知识产权的抗肿瘤药物乃当务之急[1-2].多金属氧酸盐(Polyoxometalates，POMs)又称多酸，包括杂多酸和同多酸，是由d0组态的过渡金属离子与氧高度聚合形成的具有空间网络结构的金属-氧簇合物[3]，其抗肿瘤作用研究已有30多年的历史，具有抗肿瘤作用广、对肿瘤细胞均有一定抑制作用的优点，某些种类的多酸在抑瘤效果上较之现在市售的商品药物更令人满意[4-9].近些年的研究报道表明，尽管POMs类化合物具有一定的抗肿瘤活性，但在溶解性、药物活性和细胞内靶点特异性方面还不尽如人意，通过POMs结构的改进和配位集团修饰，可以合成不同结构和特性的新分子，能为进一步筛选高效抗肿瘤新药提供备选分子.[10-16]

仲钨酸盐-B是一种经典的同多酸，多阴离子结构式为[H2W12O42]10-，它具有优异的抗艾滋病毒活性[9].但是目前没有关于仲钨酸盐-B类结构多酸化合物抗肿瘤作用的研究报道.本文使用自主研发的一种过渡金属铜修饰的仲钨酸盐化合物[Na2(H2O)10][Cu4(H2O)12(H2W12O42)]·15H2O(简称Na2Cu4W12)[17]，选择人宫颈癌Hela细胞对其体外抗肿瘤活性进行了研究.

1实验部分

1.1仪器和试剂

仪器：苏州苏静集团FLB-lB型超净工作室；美国SHELL/JB型CO2恒温细胞培养箱；日本Olympus倒置相差显微镜；日本KA-1000型低速离心机；BIORAD公司680型酶标仪；美国BD公司BD FAC ScantoTM流式细胞仪.

试剂：3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)及DMSO购自美国sigma公司；胎牛血清(Fetalbovineserum)、RPMI 1640(pH7.0～7.2)、胰蛋白酶(tyrsin)均购自Gibco公司；双抗(青霉素钠、硫酸链霉素)购自西安制药公司；Hoechst33258试剂盒、碘化丙啶(Propidium Iodine，PI)均购自南京凯基生物工程研究所；[Na2(H2O)10][Cu4(H2O)12(H2W12O42)]·15H2O为自制单晶，结构经过X射线单晶衍射、红外光谱、元素分析表征[17]，精密称取溶于DMSO中，再用培养液稀释成终浓度为100 mmol·L-1的母液，4℃保存备用；Hela细胞株来自吉林医药学院科学实验室.

1.2MTT法测肿瘤细胞活力

把对数生长期的Hela细胞调成密度为1×105个/mL，在96孔培养板中每孔加入200 μL密度为1×105个/mL的Hela细胞悬液，在37℃、5% CO2条件下培养，24 h后把Hela细胞分为两大组.将细胞分成空白对照组及实验组(浓度为0.1，1，10，20，50及100 μmol/L的药物溶液共6组)，用DMEM培养基稀释液分别培养24 h.培养结束每孔加入新鲜配制的MTT溶液20 μL，温育4 h使MTT还原为甲瓒，当在倒置显微镜下看到孔板内的细胞周围出现丝状紫色结晶体时倒掉上清液，每孔加DMSO 150 μL 震荡溶解细胞，用平板摇床摇匀后，使用酶标仪测定其光密度值(OD)(检测波长为570 nm).计算增殖抑制率的公式：增殖抑制率=(1-药物试验组吸光度值/对照组吸光度值)×100%.重复试验3次，取平均值.

1.3细胞凋亡的形态学观察

取对数生长期的Hela细胞，培养24 h后，去上清液，将细胞分成空白对照组和实验组(浓度为0.1，1，10，20，50及100 μmol/L的药物溶液200 μL)，用DMEM培养基稀释液培养24 h后，于倒置显微镜下观察不同浓度对肿瘤细胞的影响，从生长抑制、细胞形态进行评估.

1.4Annex in V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率

取对数生长期Hela细胞5×105个接种于25 cm2细胞培养瓶中，待细胞贴壁后，更换培养液，加入总浓度为0，0.1，1，10，20，50及100 μmol/L的药物溶液10 mL，其中0为阴性对照，12 h后收集对照组和实验组细胞，PBS洗涤2次，在温度为4℃时用70%乙醇固定30 min，用Annex in V-FITC/PI双标记染色后上机检测细胞凋亡率.

2结果与讨论

2.1MTT比色实验

由于活细胞的线粒体具有还原MTT形成紫色化合物的能力，该化合物在570 nm波长下有强吸收.细胞死亡或增殖功能下降时，还原MTT的能力下降，570 nm波长下吸光度值会降低(见表1).由表1可见，与对照组比较，不同浓度的Na2Cu4W12处理Hela细胞24 h后，可使Hela细胞的OD值明显减小，表明Na2Cu4W12对Hela细胞具有抑制作用，且随着浓度的增加细胞的存活率下降，具有药物剂量依赖性，IC50为10.2 μmol/L.

图1　表1　不同浓度Na2CuW12处理Hela细胞24 h后OD值抑制率和IC50

注：OD值为光密度值.

2.2不同浓度Na2Cu4W12对肿瘤细胞形态学的影响

分别用0.1，1，10，20，50，100 μmol/L浓度的Na2Cu4W12处理肿瘤24 h后，结果显示:实验组的肿瘤细胞紧贴瓶底，细胞密集，细胞间连接紧密，呈有规则的多边形，细胞触角较短，圆形细胞少；Na2Cu4W12处理后，细胞较为稀疏，附壁疏松，脱壁，细胞变圆.图1为浓度50 μmol/L的Na2Cu4W12对肿瘤细胞形态学的影响.

a：空白对照组；b：50 μmol/L Na2Cu4W12处理的Hela

2.3不同浓度的Na2Cu4W12对Hela细胞早期凋亡率的影响

正常生长的Hela细胞早期凋亡率为3.07%.经不同浓度Na2Cu4W12处理12 h后，Hela细胞早期凋亡率显著增加，0.1，1，10， 20，50和100 μmol/L Na2Cu4W12组分别为4.15%，10.67%，13.51%，23.29%，34.86%和44.4% (见图2).早期凋亡细胞所占的百分比由3.07%增加到44.4%；表明Na2Cu4W12诱导Hela细胞的死亡性质为凋亡，且其作用具有明显剂量依赖性.

a为对照组；b为0.1 μmol/L；c为1 μmol/L；d为10 μmol/L；e为20 μmol/L；f为 50 μmol/L;g为100 μmol/L

象限 1为死亡细胞(UL左上)；象限2为晚期凋亡(UR右上)；象限3为正常细胞(LL左下 )；象限4为早期凋亡(LR 右下)

图2不同浓度Na2Cu4W12作用12 h后Annex in V-FITC/ PI 双染法检测Hela细胞凋亡率

3结论

本文探讨了过渡金属铜修饰的仲钨酸盐化合物Na2Cu4W12对人宫颈癌Hela细胞生长及凋亡的影响.MTT细胞活性检测、光学显微镜细胞凋亡形态观察以及细胞流式仪检测表明：Na2Cu4W12对Hela细胞有较明显的抑制作用，IC50为10.2 μmol/L；光学显微镜下处理组细胞出现皱缩、变圆、缩小等形态变化；不同浓度Na2Cu4W12处理12 h后早期凋亡细胞所占的百分比显著增加且呈剂量依赖性.通过诱导肿瘤细胞调亡进行肿瘤治疗是抗癌治疗的新观点，比杀伤肿瘤细胞的治疗有明显的优越性，故寻找能有效诱导肿瘤细胞凋亡的药物是目前的研究热点.本文首次发现仲钨酸盐化合物Na2Cu4W12具有抑制宫颈癌细胞株Hela细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用，其抗肿瘤活性有进一步研究价值.

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Inhibitory effect of [Na2(H2O)10][Cu4(H2O)12(H2W12O42)]·15H2O

(责任编辑：石绍庆)

on the growth of human cervical carcinoma Hela cells

QU Xiao-shu1，LIU Shu-ping2，NING Bo3，YANG Yan-yan1

(1.Chemical and Pharmaceutical Engineering Institute，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin 132022，China；2.College of Tourism and Cuisine，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China；3.School of Food Production and Biotechnology，Changchun Vocational Institute of Technology，Changchun 130021，China)

Abstract:The in vitro anti-tumor activity of a novel paradodecatungstate-B compound decorated by transition metal copper：[Na2(H2O)10][Cu4(H2O)12(H2W12O42)]·15H2O (abbreviated form：Na2Cu4W12)has been studied.Hela cells were treated with different concentration of Na2Cu4W12，then its IC50was measured by MTT assay；The morphological change in Hela cells were observed by optical microscopes；Flow cytometry was applied to analyze cell cycle and apoptosis by computing the ratio of Hela cells in different phase and its apoptotic ratio.The results show that Na2Cu4W12can inhibit Hela cell proliferation with IC50of 10.2 μmol/L，showing dose-dependent.Under the optical microscopes，The number of Hela cells treated with Na2Cu4W12decreased significantly，cell rounding，shrinking and aging were observed.Treated with different concentrations of Na2Cu4W12after 12 h，the proportions of Hela cells on the early apoptosis increased markedly，showing dose-dependent.

Keywords:[Na2(H2O)10][Cu4(H2O)12(H2W12O42)]·15H2O；human cervical carcinoma Hela cell；anti-tumor；in vitro study

[文章编号]1000-1832(2016)02-0103-05

[收稿日期]2015-01-10

[基金项目]国家自然科学基金资助项目(21301041).

[作者简介]曲小姝(1974—)，女，博士，副教授，主要从事多酸化学和配位化学研究.

[中图分类号]O 611[学科代码]150·15

[文献标志码]A

[DOI]10.16163/j.cnki.22-1123/n.2016.02.022