疏肝和胃方对胃食管反流大鼠模型背根神经节中TRPV1表达的影响*

曹会杰　刘春芳　程艳梅　张秀莲　王宏伟　朱生樑△（.上海中医药大学附属普陀医院，上海　0000；.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海　00437）



疏肝和胃方对胃食管反流大鼠模型背根神经节中TRPV1表达的影响*

曹会杰1刘春芳2程艳梅2张秀莲2王宏伟2朱生樑2△
（1.上海中医药大学附属普陀医院，上海200002；2.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海200437）

【摘要】目的观察疏肝和胃方对胃食管反流大鼠模型背根神经节中内脏敏感因子瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1）表达的影响，探讨其治疗胃食管反流病的机理。方法将40只SD大鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、中药组及西药组，每组10只，除正常组外均行贲门肌切开术加幽门半结扎术制备反流性食管炎模型，并分别给予相应干预措施。免疫组化法及实时荧光定量核酸扩增检测（QPCR）方法观察各组大鼠背根神经节TRPV1受体及TRPV1 mRNA的表达。结果与正常组相比，模型组、西药组大鼠背根神经节中TRPV1阳性表达明显增高（P＜0.05）；中药组与正常组比较无统计学差异（P＞0.05）；与西药组比较，中药组TRPV1阳性表达明显降低（P＜0.05）。模型组背根神经节组织中TRPV1 mRNA表达水平明显高于正常组、中药组及西药组（P＜0.05）；中药组、西药组与正常组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；中药组与西药组比较，两组背根神经节组织中TRPV1 mRNA表达差异无统计学意义（P＞0.05）。结论疏肝和胃方可能通过抑制TRPV1过度表达来发挥其治疗胃食管反流病的作用。

【关键词】胃食管反流病反流性食管炎瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1）疏肝和胃方

胃食管反流病是指胃内容物反流入食管、口腔（包括喉部）或肺所致的症状和（或）并发症［1］。目前认为，内脏敏感因子瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1）在胃食管反流病的发病中发挥着重要作用。食管炎患者TRPVl在食管乳头部的表达与反酸等症状显著相关［2］。疏肝和胃方（柴胡、枳壳、旋覆梗、代赭石、香附、煅瓦楞、延胡索、太子参、黄连、吴茱萸、甘草）是上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院胃食管反流病专科门诊长期应用的经验方，其治疗胃食管反流病临床效果显著［3］。本研究观察了疏肝和胃方对胃食管反流大鼠模型背根神经节TRPV1受体及TRPV1 mRNA表达的影响，以阐述其治疗胃食管反流病的作用机制。现报告如下。

1　材料与方法

1.1实验动物SD大鼠40只，健康雄性，体质量（250±20）g，由上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院实验动物中心提供，上海市斯莱克实验动物有限责任公司生产（动物许可证号SCXK（沪）2012-0002）。常规饲养。

1.2试剂与仪器兔抗TRPV1一抗、羊抗兔IgG二抗、DAB显色试剂盒购自武汉博士德公司；0.5%伊红、苏木素、二甲苯、梯度酒精由上海市制药七厂生产；0.01 mol/L柠檬酸钠抗原修复液、3%过氧化氢由上海天贺生物有限公司提供；微量样本RNA提取试剂盒（DP420）、DEPC H2O（750024）、逆转录酶（R250-01）、荧光染料SYBR Green I（CS7561）、Rnase Inhibitor （E00381）、oligodT/Randomprimer/特异性引物、100 mM dNTPs（18427 013）、Platinum Taq DNA Polymerase均购自Invitrogen公司。半自动脱水机TP1020（Leica）、全自动石蜡包埋机EG1150（Leica）、全自动石蜡切片机RM2235（Leica）、光学显微镜H550S（Nikon Eclipse 50 i）、计算机图像分析系统（IPWIN60）、高速冷冻离心机Neofuge13R（Heal Force）、生物安全柜HFsafe 1200 A2 （Heal Force）、荧光定量PCR仪CFX96TM型（Bio Rad）。疏肝和胃方药物组成：旋覆梗12 g，代赭石15 g，柴胡9 g，枳壳12 g，香附9 g，煅瓦楞30 g，延胡索9 g，太子参9 g，黄连3 g，吴茱萸3 g，甘草6 g。采用中药颗粒剂（由本院药剂科提供），使用前配成溶液。奥美拉唑胶囊（由常州四药生产，批号20130320，规格为20 mg/粒），使用前配成溶液。

1.3分组与造模40只SD大鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、中药组及西药组，每组10只。除正常组外，其余3组大鼠均参照国内外文献报道行贲门肌切开术加幽门半结扎术复制胃食管反流病模型［4-5］。

1.4给药方法造模后1周，中药组予疏肝和胃方颗粒剂，用前将颗粒剂配制成0.641 g/mL混悬液；西药组予奥美拉唑胶囊，用前配制成0.208 mg/mL混悬液；每次按1 mL/100 g体质量，每日2次灌胃，连续14 d。模型组和正常组予等量0.9%氯化钠注射液。各组于造模后第22日处死。

1.5观察方法处死大鼠后，充分暴露胸椎段脊髓，将脊神经后段及其出椎管处膨大呈串珠样的背根神经节取下，一部分置于4%多聚甲醛中，一部分储存于-80℃冰箱。1）免疫组化法检测大鼠背根神经节中TRPV1受体的表达。背根神经节置于4%多聚甲醛中4℃冰箱固定2 h；PBS冲洗3次；将组织块浸入含20%蔗糖的PBS液4℃过夜，第2日包埋、冰冻切片，37℃温箱30 min；常规二甲苯，乙醇脱蜡至水，PBS洗3×3 min；用0.01 mol/L柠檬酸钠抗原修复液（pH6.0），煮沸热修复（95℃15 min），保温15 min，室温自然冷却，PBS洗3×3 min；3%H2O2抑制内源性过氧化物酶室温孵育10 min；PBS洗3×3 min；10%正常胎牛血清室温孵育30 min；PBS洗3×3 min；一抗4℃孵育过夜；PBS洗3×3 min；二抗37℃孵育1.5 h；PBS洗3×3 min；DAB显色3～5 min；苏木素复染30 s，盐酸酒精分化1 s；脱水吹干后，树脂封片。2）图像分析。使用IPWIN60图像分析系统。在Nikon光学显微镜高倍镜（×400）下每张切片随机选取3个视野进行观察，并采集图像，测定一定面积内，免疫组化图像中阳性区域面积比以及光密度值（Optical Density）。免疫组化阳性指数=阳性面积比×平均光密度。3）QPCR法检测大鼠背根神经节中TRPV1 mRNA表达。采用Tiangen公司DP420试剂盒进行RNA抽提，取50 μg左右组织，加入1 mL Trizol液，充分匀浆；22℃，静置5 min，加入氯仿0.2 mL，颠倒15 s；22℃，静置3 min；4℃×14000转/min×15 min离心，取上清液0.5 mL，加入0.5 mL异丙醇，混匀；22℃，静置10 min；4℃×14000转/min×10 min离心，弃上液，加入1 mL 4℃75%乙醇；4℃×10000转/min× 5 min离心，弃上液，真空干燥5 min；用40 μL DEPC处理水溶解，-80℃保存。引物参照GenBank序列。RAT TRPV1上游引物5’-CGGTGGTGACGCTGATTG AAGAC-3’，下游引物5’-GTTGAGCA GGAGGATGTA GGTGAGA-3’，扩增片段177 bp采用荧光染料SYBR Green（CS7561）嵌合荧光法进行PCR扩增，仪器采用CFX96TM型实时荧光定量PCR仪。PCR反应条件为95℃10 s；95℃5 s；60℃20 s，40个循环。采用ΔΔCT法加以分析，以ddH2O作为阴性对照，样本的相对表达量=2-ΔΔCT。

1.6统计学处理应用SPSS18.0统计软件分析。符合正态分布以（x±s）表示，符合正态分布和方差齐性采用单因素方差分析，如不符合正态分布或方差齐性则采用秩和检验进行比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组大鼠背根神经节TRPV1阳性表达比较见表1，图1。免疫组化结果显示，TRPV1阳性表达于神经元的细胞质及细胞膜内，而细胞核无明显表达。与正常组相比，模型组、西药组大鼠背根神经节中TRPV1阳性表达明显增高（P＜0.05）；中药组与正常组比较无统计学差异（P＞0.05）；西药组与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与西药组比较，中药组TRPV1阳性表达明显降低（P＜0.05）。

表1　各组大鼠背根神经节TRPV1阳性表达比较（x±s）

图1　各组大鼠背根神经节TRPV1表达免疫组化图（苏木素，×400）

2.2各组大鼠背根神经节TRPV1 mRNA表达比较见表2。正常组大鼠背根神经节中含有少量的TRPV1 mRNA表达。模型组背根神经节组织中TRPV1的mRNA表达水平明显高于正常组、中药组及西药组（P＜0.05）；中药组、西药组与正常组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；且中药组与西药组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2　各组大鼠背根神经节TRPV1 mRNA表达比较（x±s）

3　讨论

TRPV1是一种非选择性阳离子通道，主要表达于背根神经节中，也分布于胃肠道中，主要存在于伤害感受器上，参与炎性、机械性和温度性的痛觉发生和痛觉过敏形成［6-7］。研究发现TRPV1参与了食管神经源性炎症的发生，与P物质、降钙素基因相关肽的释放有关［8］。将人食管上皮细胞培养于酸化的细胞培养基中，模拟胃食管反流病中食管黏膜的酸暴露，可发现细胞中TRPV1 mRNA及其蛋白表达上调，同时细胞中巨噬细胞炎性蛋白-1α和单核细胞趋化蛋白-1等趋化因子的表达也相应增加，而应用TRPV1拮抗剂后趋化因子表达明显降低［9］，这提示在食管酸暴露的情况下，TRPV1激活后会促进趋化因子释放，进而加重食管黏膜炎症。当食管黏膜长期暴露于酸环境中，食管内pH下降，进而激活了食管黏膜及周围神经中的酸敏感离子通道，沿传入神经传至中枢神经，引起背根神经节中TRPV1的开放，TRPV1可将化学刺激、机械刺激等多种伤害性信号整合，尤其对痛觉信号更为敏感，TRPVl的开放导致痛觉阈值的降低，进一步导致伤害感受器兴奋性升高，最终大脑中枢对感觉阈值进行下调，沿传出神经传出后使得患者对正常生理刺激或低强度的阈下刺激变得敏感。另外TRPV1激活还可促进神经源性炎症神经肽的释放，加剧炎症反应。本研究中模型组大鼠背根神经节中的TRPV1含量较正常组明显增高，从而表明在胃食管反流病的发病过程中，TRPV1受体水平的上调可导致食管高敏化，进而加重食管黏膜炎症反应。

胃食管反流病属于中医学“食管瘅”“吐酸”等范畴。疏肝和胃方乃紧切本病肝胆失于疏泄、胃失和降，胃气上逆的基本病机组方而成，具有疏肝利胆、通降和胃的功效。方中柴胡、枳壳、代赭石、旋覆梗升降相因，共奏疏肝理气、和胃降逆之效；黄连、吴茱萸寒热并用，辛开苦降，清降肝胃郁火、制酸和胃；延胡索行气止痛；香附配合柴胡等加强疏肝解郁，行气止痛之效；煅瓦楞功在制酸止痛；太子参、甘草健脾养胃、调和诸药。诸药配伍从整体上协调各脏腑之间的功能，同时紧紧围绕调节气机，使肝胆脾胃中焦气机归于正常，邪去正安，则诸症俱消。前期研究显示，疏肝和胃方治疗胃食管反流病具有良好疗效［3］，且对反流性食管炎大鼠模型食管黏膜炎症具有明显改善作用［10］，但其作用机制并不十分清楚。本实验在上述基础上，证明疏肝和胃方对胃食管反流病大鼠模型背根神经节中TRPV1的表达具有一定的调控作用，通过抑制TRPV1的高表达，使被激活或致敏的TRPV1恢复正常，减少痛觉的传导，进而改善食管黏膜炎症。

参考文献

［1］atz PO，Gerson LB，Vela MF.Guidelines for the diagnosis and management of gasfoesophageal reflux disease［J］.Am J Gastroenterol，2013，108（3）：308-328．

［2］Matthews PJ，Aziz Q.Increased capsaicin receptor TRPV1 nerve fibres in the infla med human oesophagus［J］.Eur J Gastroenterol Hepatol.2004，16（9）：897-902.

［3］李黎，朱生樑.疏肝和胃方治疗58例胃食管反流病相关性胸痛临床观察［J］．辽宁中医杂志，2009，36（2）：220-222.

［4］Melih T，Firuzan Y，Tijen U，et al.Esophagitis impairs esophageal smooth muscle reactivity in the rat model：An in vitro study［J］.Dig Dis Sci，2003，48（11）：2147-2152.

［5］袁红霞，于强，崔乃强.旋复代赭汤对酸性反流性食管炎模型大鼠食管黏膜通透性的影响［J］.北京中医药大学学报，2003，26（5）：56-59.

［6］Caterina MJ，Julius D.The vanilloid receptor A molecular gateway to the pain path way［J］.Annu Rev Neurosci，2001， 24：487-517.

［7］Tominaga M，Caterina MJ，Malmberg AB，et a1.the cloned capsaicin receptor integra tes.multiple pain -producing stimul［J］.Neuron，1998，21（3）：531-643.

［8］Hiroto Miwa，Takashi Kondo，Tadayuki Oshima，et al.Esophageal Sensation and Esophageal Hypersensitivity -Overview From Bench to Bedside［J］.J Neurogastroent Erol Motil，2010，16（4）：353-362.

［9］Ma J，Altomare A，Guarino M，et a1.HCl-induced and ATP-dependent upregulation of TRPV1 receptor expression and cytokine production by human esophageal epitheli al cells［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2012，303（5）：635-645.

［10］程艳梅，朱生樑，马淑颖，等.通降和胃方对大鼠混合反流性食管炎食管上皮的影响［J］.山西中医，2005，21（1）：46-48.

Influence of Shugan Hewei Decoction onTRPV1 in Dorsal Root Ganglia of Rats with Reflux Esophagitis

CAO Huijie，LIU Chunfang，CHENG Yanmei，et al.Putuo Central Hospital Affiliated to Shanghai Medicine University，Shanghai 200002，China.

【Abstract】Objective：To observe the influence of Shugan Hewei Decoction on TRPV1 in dorsal root ganglia of rats with reflux esophagitis and explore the mechanism of the treatment of gastroesophageal reflux disease.Methods：Fourty healthy male Spregue-Dawley（SD）rats were randomly divided into 4 groups（n = 10）：the normal group，the model group，TCM group，Western medicine group.Reflux esophagitis models were induced by cardiomyotomy and pylorus semiligation，and given the corresponding intervention measures.Expression of TRPV1 receptors and the expression of TRPV1mRNA in dorsal root ganglia of rats were observed with immunohistochemical method and QPCR.Results：Compared with the normal group，positive expressions of TRPV1 in model group and Western medicine group were significantly higher（P＜0.05）.There was no significant difference between the treatment group and TCM group（P＞0.05）.Compared with Western medicine group，the positive expression of TRPV1 was significantly decreased in TCM group；the difference was statistically significant（P＜0.05）.The expression level of TRPV1mRNA in model group was significantly higher than normal group，TCM group and Western medicine group（P＜0.05）.The difference was not statistically significant between normal group，TCM group and Western medicine group（P＞0.05）.The expression of TRPV1mRNA in the last two groups was not statistically significant（P＞0.05）.Conclusion：The mechanism of Shugan Hewei Decoction on gastroe sophageal reflux disease may inhibitting the overexpression of TRPV1.

【Key words】Gastroesophageal reflux disease；Reflux esophagitis；Transient receptor potential cation channel 1；Shugan Hewei Decoction

中图分类号：R285.5

文献标志码：A

文章编号：1004-745X（2016）04-0623-04

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.04.017

*基金项目：国家中医药管理局“十二五”重点专科项目（No.09JIX1L206B118）；上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院科研基金项目（No.30304115238）

通信作者△（电子邮箱：lef2_hb@163.com）

收稿日期（2015-12-02）