去肾交感神经术对心肌梗死犬下丘脑血管紧张素Ⅱ及氧化应激水平的影响

马艺杰，卢成志，李超，张瑾，王丽，宋立君



去肾交感神经术对心肌梗死犬下丘脑血管紧张素Ⅱ及氧化应激水平的影响

马艺杰1，卢成志2，李超2，张瑾2，王丽2，宋立君3

摘要:目的探讨去肾交感神经术对心肌梗死（MI）犬下丘脑血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）及氧化应激水平的影响。方法18只犬随机均分为MI组、MI+去肾交感神经术组（RDN组）和假手术组。前2组通过明胶海绵栓塞法建立MI模型，假手术组只行冠脉造影检查。MI后1周对RDN组行去肾交感神经术，余2组只行肾动脉造影检查。MI后4周检测AngⅡ、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）的含量及尼克酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH）氧化酶亚基gp91phox蛋白的表达。结果与假手术组相比，MI组下丘脑AngⅡ、MDA含量增加，gp91phox蛋白表达增加，SOD活性降低（P＜0.01）。MI组AngⅡ与SOD活性呈负相关，与gp91phox蛋白表达量呈正相关（r分别为-0.849和0.950，P＜0.01）。RDN组较MI组AngⅡ、MDA含量降低，gp91phox蛋白表达降低，SOD活性增加（P＜0.01）。结论去肾交感神经术可以降低下丘脑AngⅡ含量，抑制NADPH氧化酶表达，降低氧化应激水平，改善MI后心功能。

关键词:心肌梗死；下丘脑；血管紧张素Ⅱ；氧化性应激；疾病模型,动物；去肾交感神经术

作者单位：1天津医科大学一中心临床学院（邮编300192）；2天津市第一中心医院心内科，3消化科

心肌梗死（MI）时，交感神经的过度激活会促进MI后心肌、交感神经重构，导致心力衰竭（心衰）、恶性心律失常等的发生，影响远期预后[1-2]。因此，抑制增强的交感神经活性是MI治疗的重要靶点。下丘脑是神经内分泌活动的重要调节中枢，通过多种机制主动参与交感神经活性的调节[3]，其中肾素-血管紧张素系统(RAS）、活性氧簇（ROS）等体液机制起重要作用[4]。去肾交感神经术（renal denervation, RDN）通过选择性阻断肾交感神经，除可用于顽固性高血压的治疗[5]外，还可用于左室肥厚、恶性心律失常、心功能不全等其他高交感神经活性疾病的治疗[6-7]。然而，目前有关RDN治疗MI的中枢机制尚未明确。Yu等[4]在MI大鼠下丘脑内发现,尼克酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)氧化酶活性增加,予以血管紧张素（Ang）Ⅱ受体拮抗剂可以降低NADPH氧化酶活性，抑制ROS生成，降低交感神经活性，改善心功能。因此，笔者推测抑制中枢及外周AngⅡ、氧化应激水平可以作为高交感神经活性MI的治疗靶点之一。本研究旨在观察RDN对MI犬下丘脑AngⅡ及NADPH氧化酶的影响，以探讨RDN治疗MI的可能中枢机制。

1　材料与方法

1.1主要试剂和仪器AngⅡ酶联免疫试剂盒购自上海博谷生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所；羊抗gp91phox一抗购于美国Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶标记的抗羊抗体购于北京中杉金桥；-80℃冰箱购于日本SANYO公司；Ep⁃pendorf离心机购于德国Eppendorf公司；GSM-Ⅱ麻醉呼吸机购于北京宏润达科技发展有限公司；Allura Xper FD10心血管X线系统购于荷兰Philips公司；IBI-1500T射频消融仪购于美国IBI公司；6F冷盐水消融导管购于北京心诺普医疗。

1.2实验动物及分组18只健康杂种犬，10～12月龄，雄性8只，雌性10只，购于天津春乐实验动物中心。采用简单随机化分组分为3组：假手术组6只，只行冠状动脉（冠脉）造影，1周后行肾动脉造影；MI组6只，MI造模后1周行肾动脉造影；RDN组6只，MI造模后1周行RDN。

1.3 MI模型构建及RDN模型构建参照文献[8]，6%戊巴比妥钠30 mg/kg静脉麻醉后，犬仰卧位固定，气管插管机械通气，穿刺股动脉行冠脉造影，于前降支第一对角支远端微导管注射自制直径约1 mm的明胶海绵颗粒。栓塞后10 min再次行冠脉造影，以靶血管呈“残根样”改变，确认血流阻断，作为判断构建MI模型成功的标准。造模后假手术组犬无死亡，MI组和RDN组各有1只犬分别于MI后1 d、3 d死亡。MI后1周对RDN组行RDN，连接IBI-1500T射频消融仪，设定温度43℃，功率10 W，穿刺股动脉和肾动脉造影定位后，于肾动脉主干近端约1/2处开始，由远及近行环形4点消融，每点持续90 s，对侧肾动脉重复此操作。MI组及假手术组只行肾动脉造影。

1.4下丘脑AngⅡ、gp91phox蛋白测定MI后4周处死各组犬，开颅，于灰结节和视交叉之间留取下丘脑，-80℃冰箱保存。（1）AngⅡ蛋白表达水平测定。酶联免疫吸附试验（ELISA）法测定AngⅡ含量：严格按照ELISA试剂盒说明书操作，450 nm波长下测光密度（OD）值并绘制标准曲线图。在标准曲线图上根据每个待测样品的OD值查找出其相对应的浓度。（2）Western blot检测gp91phox蛋白表达水平。按BCA蛋白定量试剂盒说明书测定各样品总蛋白浓度。上样

电泳后移至PVDF膜上，封闭，加gp91phox一抗（1∶500）4℃孵育过夜，加辣根过氧化物酶标记二抗，ECL显影并定影后Image J 1.48u软件分析蛋白条带，用目的蛋白与内参β-actin灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.5下丘脑SOD、MDA测定采用黄嘌呤氧化酶法检测SOD，硫代巴比妥酸法检测MDA，按照试剂盒说明书操作，根据标准曲线计算公式计算MDA、SOD含量。MDA含量（μmol/g）=（测定OD值-对照OD值）/（标准OD值-空白OD值）×标准品浓度÷待测样本蛋白浓度。SOD（U/mg）活力=（对照OD值-测定OD值）/对照OD值÷50%×反应液总体积/取样量÷待测样本蛋白浓度。

1.6统计学方法采用SPSS 20.0软件进行分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x ±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较用LSD-t检验，相关性采用Pearson相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组犬下丘脑AngⅡ和gp91phox蛋白表达（1）AngⅡ。MI后4周，假手术组、MI组、RDN组的AngⅡ含量（μg/L）分别为1.81±0.08、2.54±0.06及2.10± 0.09（F=120.75, P＜0.01），其中MI组、RDN组高于假手术组，RDN组低于MI组（均P＜0.01）。（2）gp91phox。假手术组、MI组、RDN组下丘脑gp91phox蛋白相对表达量分别为0.54±0.15、1.36± 0.05及0.93±0.10（F=70.39，P＜0.01）。其中MI组、RDN高于假手术组，RDN组低于MI组（均P＜0.01）。见图1。

Fig. 1 The expression of gp91phox protein in hypothalamus of three groups图1各组犬下丘脑gp91phox蛋白表达

2.2各组犬下丘脑MDA、SOD含量与假手术组比较，MI组MDA含量明显升高、SOD含量降低(P＜0.01)；与MI组比较，RDN组MDA含量降低、SOD含量升高（P＜0.01），见表1。

Tab. 1 The levels of MDA and SOD in hypothalamus of three groups表1各组犬下丘脑MDA、SOD含量（x ±s）

2.3 AngⅡ与gp91phox、SOD表达水平的相关性分析MI组AngⅡ与SOD呈负相关，与gp91phox蛋白表达量呈正相关（r分别为-0.849和0.950, P＜0.01）。

3　讨论

各种原因引起ROS生成与抗氧化系统失衡时，即可产生氧化应激[9]。ROS主要由NADPH氧化酶催化生成，其中gp91phox是其重要的功能亚基[10]。Sun等[11]在下丘脑神经元细胞中发现，AngⅡ可以增加gp91phox活性，促进ROS的生成，增加神经元活性。Su等[10]在大鼠高血压模型中证实，AngⅡ通过激活NADPH氧化酶促进ROS生成，进而参与对外周交感神经活性的调节。研究证实，RDN可以降低循环RAS，改善MI后心肌重构治疗MI；且效果优于单一血管紧张素转化酶抑制剂、AngⅡ受体拮抗剂或美托洛尔药物治疗[12]。笔者前期研究表明，RDN可以降低心脏氧化应激水平，抑制MI后心脏交感神经重构，改善心功能[13]。然而RDN对MI后中枢AngⅡ、氧化应激影响的研究甚少。本实验采用明胶海绵栓塞法构建MI模型，观察RDN对MI犬下丘脑AngⅡ、gp91phox的影响，探讨RDN治疗MI的可能中枢机制。与Yu等[4]研究结果一致，本实验发现，MI组较假手术组下丘脑局部AngⅡ含量增多，gp91phox表达增加，且下丘脑AngⅡ含量与gp91phox蛋白表达量呈正相关；行RDN后下丘脑内增加的AngⅡ及gp91phox显著降低，表明RDN可以降低MI犬中枢AngⅡ含量、抑制gp91phox表达，改善心功能。

MDA是脂质过氧化产物，代表机体氧化水平；SOD是抗氧化酶，能清除氧自由基，代表机体抗氧化水平[14]。Jing等[15]研究发现，MI大鼠血清及心肌MDA含量升高，SOD活性下降，抗氧化剂可以降低MDA含量，升高SOD活性，缩小MI面积，改善心功能。Siddiqui等[16]在临床中亦发现，MI患者血清MDA含量升高，SOD活性下降。本研究显示，MI组犬下丘脑MDA含量、gp91phox蛋白表达均较假手术组增多，同时SOD活力降低，表明下丘脑处于氧化应激状态；行RDN后MDA含量、gp91phox蛋白表达减少，SOD活力增加，表明下丘脑氧化应激水平降低，提示RDN可能通过抑制下丘脑NADPH氧化酶亚基gp91phox表达，减少ROS生成，从而降低下丘脑氧化应激水平。研究证实，中枢ROS作为AngⅡ的下游信号分子，可通过影响K+、Ca2+通道的通透性[17]、核转录因子活性[18]以及神经递质等的释放，进而介导对交感神经活性的调节。因此，RDN可能通过选择性阻断交感神经、降低下丘脑AngⅡ水平，从而降低氧化应激水平。

综上所述，RDN可以降低下丘脑AngⅡ含量、抑制NADPH氧化酶表达，进而降低氧化应激水平，改善MI后心功能。

参考文献

[1] Ajijola OA, Yagishita D, Patel KJ, et al. Focal myocardial infarction induces global remodeling of cardiac sympathetic innervation: neural remodeling in a spatial context[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2013, 305(7): H1031-1040. doi: 10. 1152/ ajpheart. 00434. 2013.

[2] Wang HJ, Wang W, Cornish KG, et al. Cardiac sympathetic afferent denervation attenuates cardiac remodeling and improves cardiovas⁃cular dysfunction in rats with heart failure[J]. Hypertension, 2014, 64(4): 745-755. doi: 10. 1161/ HYPERTENSIONAHA.114.03699.

[3] Kang YM, Zhang DM, Yu XJ, et al. Chronic infusion of enalaprilat into hypothalamic paraventricular nucleus attenuates angiotensin Ⅱ-induced hypertension and cardiac hypertrophy by restoring neu⁃rotransmitters and cytokines[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2014, 274 (3):436-444. doi: 10. 1016/ j. taap. 2013. 12. 001.

[4] Yu XJ, Suo YP, Qi J, et al. Interaction between AT1 receptor and NF-κB in hypothalamic paraventricular nucleus contributes to oxi⁃dative stress and sympathoexcitation by modulating neurotransmit⁃ters in heart failure[J]. Cardiovasc Toxicol, 2013, 13(4): 381-390. doi: 10. 1007/s12012- 013- 9219- x.

[5] Esler MD, Böhm M, Sievert H, et al. Catheter-based renal denerva⁃tion for treatment of patients with treatment-resistant hypertension: 36 month results from the SYMPLICITY HTN-2 randomized clini⁃cal trial[J]. Eur Heart J, 2014, 35(26): 1752-1759. doi: 10. 1093/ eurheartj/ ehu209.

[6] Schirmer SH, Sayed MM, Reil JC, et al. Improvements in left ven⁃tricular hypertrophy and diastolic function following renal denerva⁃tion: effects beyond blood pressure and heart rate reduction[J]. J Am Coll Cardiol, 2014, 63(18): 1916-1923. doi: 10. 1016/ j. jacc. 2013. 10. 073.

[7] Hoffmann BA, Steven D, Willems S, et al. Renal sympathetic dener⁃vation as an adjunct to catheter ablation for the treatment of ventric⁃ular electrical storm in the setting of acute myocardial infarction[J]. J Cardiovasc Electrophysiol, 2013, 24(10): 1175- 1178. doi: 10. 1111/ jce. 12207.

[8] Wen X, Li R, Yang P, et al. Optimizing a canine model of myocardi⁃al infarction using a minimally invasive interventional method[J]. Exp Clin Cardiol, 2014, 20(1):338-365.

[9] Lassègue B, San Martín A, Griendling KK. Biochemistry, physiolo⁃gy, and pathophysiology of NADPH oxidases in the cardiovascular system[J]. Circ Res, 2012, 110(10):1364-1390. doi: 10. 1161/ CIR⁃CRESAHA. 111. 243972.

[10] Su Q, Qin DN, Wang FX, et al. Inhibition of reactive oxygen species in hypothalamic paraventricular nucleus attenuates the renin-angio⁃tensin system and proinflammatory cytokines in hypertension[J]. Toxicol Appli Pharmacol, 2014, 276 (2):115-120. doi: 10. 1016/j.taap. 2014.02.002.

[11] Sun C, Sellers KW, Sumners C, et al. NAD(P)H oxidase inhibition attenuates neuronal chronotropic actions of angiotensinⅡ[J].Cir⁃cRes, 2005, 95(4):659-666.

[12] Jialu H, Yuemei H, Junbo G. A comparison of the efficacy of renal denervation and pharmacologic therapies in post-myocardial infarc⁃tion heart failure[J]. J Am Coll Cardiol, 2014, 64(16):C81-C82. doi: 10. 1371/ journal. pone. 0096996.

[13] Song LJ, Lu CZ, Li C, et al. Effect of renal denervation on cardiac oxidative stress and sympathetic nerve remodeling after myocardial infarction in canine[J]. Tianjin Med J, 2015,43(8):864-867.[宋立君,卢成志,李超,等.去肾交感神经术对心肌梗死后犬心脏氧化应激和交感神经重构的影响[J].天津医药, 2015, 43(8):864-867]. doi:10.11958/j.issn.0253-9896.2015.08.009.

[14] Niizuma K, Yoshioka H, Chen H, et al. Mitochondrial and apoptotic neuronal death signaling pathways in cerebral ischemia[J]. Biochim Biophys Acta, 2010, 1802(1):92-99. doi: 10.1016/j.bbadis.2009.09. 002.

[15] Jing L, Wang Y, Zhao XM, et al. Cardioprotective effect of hydrogenrich saline on isoproterenol-induced myocardial infarction in rats [J]. Heart LungCirc, 2015, 24(6):602-610. doi: 10.1016/j.hlc.2014.11. 018. [16] Siddiqui AH, Gulati R, Tauheed N, et al. Correlation of waist-tohip ratio (whr) and oxidative stress in patients of acute myocardial infarction (AMI) [J]. J Clin Diagn Res, 2014,8(1):4- 7. doi: 10. 7860/ JCDR/ 2014/ 6446. 3912.

[17] Yin JX, Yang RF, Li S, et al. Mitochondria-produced superoxide mediates angiotensinⅡ-induced inhibition of neuronal potassium current[J].Am J Physiol Cell Physiol, 2010,298(4):C857-865. doi: 10. 1152/ ajpcell. 00313. 2009.

[18] Young CN, Li A, Dong FN, et al. Endoplasmic reticulum and oxidant stress mediate nuclear factor-κB activation in the subfornical organ during angiotensinⅡhypertension[J].Am J Physiol Cell Physiol, 2015, 308(10):C803-812. doi: 10.1152/ajpcell.00223. 2014.

（2015-07-20收稿2015-10-03修回）

（本文编辑陆荣展）

The effects of renal denervation on hypothalamus angiotensinⅡand oxidative stress in myocardial infarction dogs

MA Yijie1, LU Chengzhi2, LI Chao2, ZHANG Jin2, WANG Li2, SONG Lijun3
1 First Center of Clinical College, Tianjin Medical University，Tianjin 300192, China; 2 Department of Cardiology, 3 Department of Gastroenterology, Tianjin First Center Hospital Corresponding Author E-mail:lucz8@126.com

Abstract:Objective To explore the effects of renal denervation (RDN) on hypothalamus angiotensinⅡ(AngⅡ) and oxidative stress in myocardial infarction (MI) dogs. Methods Eighteen mongrel dogs were randomly divided into MI group (n=6), RDN group (n=6) and sham operation group (n=6). Myocardial infarction model was made in the former two groups by gelatin sponge embolization of the left anterior descending artery. One week after MI, RDN was given to dogs in RDN group. Levels of AngⅡ, malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD) and expression of gp91phox protein were detected four weeks after MI. Results Compared with control group, hypothalamus AngⅡ, MDA and expression of gp91phox protein were increased in MI group (P＜0.01), but SOD was decreased (P＜0.01). There was a negative correlation between AngⅡand SOD activity in MI group (r=-0.849, P＜0.01). There was a positive correlation between AngⅡand expression of gp91phox protein in MI group (r=0.950, P＜0.01). Compared with MI group, hypothalamus AngⅡ, MDA and expression of gp91phox protein were decreased in RDN group (P＜0.01), but SOD was increased (P＜0.01). Conclusion RDN can de⁃crease the level of hypothalamus AngⅡand the level of hypothalamus oxidative stress, and improve heart function of MI dogs.

Key words:myocardial infarction；hypothalamus；angiotensinⅡ；oxidative stress；disease models, animal；renal dener⁃vation surgery

中图分类号：R542.22

文献标志码：A

DOI：10.11958/20150032

基金项目：天津市应用基础与前沿技术研究计划项目（14JCYBJC26100）；天津市卫生局科技基金项目（2014KY11）

作者简介：马艺杰（1990），女，硕士在读，主要从事高血压、冠心病研究

通讯作者E-mail：lucz8@126.com