不同剂量137Csγ-射线辐射后造血干/祖细胞辐射敏感性差异研究

路璐，李德冠，张俊伶，王月英，孟爱民



不同剂量137Csγ-射线辐射后造血干/祖细胞辐射敏感性差异研究

路璐1，李德冠1，张俊伶1，王月英1，孟爱民2

摘要：目的探讨不同剂量137Csγ-射线辐射后不同时间点C57BL/6小鼠造血细胞辐射敏感性的差异。方法采用随机区组法将72只雄性C57BL/6小鼠分为对照组和2、4、6 Gy照射组。照射组给予2、4、6 Gy137Csγ-射线一次性全身照射，对照组给予假照射。分别于受照后14 d、35 d和56 d断颈处死小鼠，取外周血进行血象测定，取骨髓细胞测定有核细胞（BMNCs）、造血干细胞（HSCs）和造血祖细胞（HPCs）数目。结果与对照组相比，照射组小鼠造血系统受到不同程度损伤。外周血白细胞计数（WBC）、红细胞数（RBC）、血小板（PLT）和血红蛋白含量（HGB）均有不同程度的降低，其中HGB对辐射较不敏感，RBC在受照后35 d已基本恢复至正常值，WBC和PLT对辐射较敏感；6 Gy照射对WBC和PLT影响较重，恢复缓慢。照射后14 d，照射组BMNCs、HSCs和HPCs数目均低于对照组；照射后35 d和56 d，6 Gy照射组BMNCs和HPCs数目均低于对照组（均P＜0.05），2、4 Gy照射组BMNCs和HPCs数目与对照组差异无统计学意义。照射后35 d，照射组HSCs数目均低于对照组；照射后56 d，4、6 Gy照射组HSCs数目均低于对照组（均P＜0.05），2 Gy照射组HSCs数目与对照组差异无统计学意义。结论不同剂量137Csγ-射线辐射对小鼠造血系统造成不同程度的损伤，且辐射对HSCs的损伤是持久性的。

关键词：γ射线；外周血；造血干细胞；造血祖细胞；137Cs

作者单位：1中国医学科学院北京协和医学院放射医学研究所，天津市放射医学与分子核医学重点实验室（邮编300192）；2中国医学科学院实验动物研究所

电离辐射可以直接或通过续发反应导致机体广泛损伤，包括急性损伤、迟发性损伤和慢性损伤，其中造血系统损伤是辐射损伤的主要表现之一[1-3]。造血系统对辐射极其敏感，各种造血前体细胞、造血祖细胞（hematopoietic progenitor cells, HPCs）在形成成熟血细胞的过程中不断地分化、增殖，对辐射高度敏感[4-5]。以往对于造血系统辐射损伤的研究绝大部分着重于大剂量照射后的损伤效应[2]，然而有关低、中、高剂量全身照射后造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）和HPCs的损伤和修复规律的报道较少。本研究对不同剂量137Csγ-射线全身照射后不同时间点小鼠的造血功能进行系统研究，并探讨HSCs 和HPCs放射敏感性的差异。

1　材料与方法

1.1试剂与仪器137Csγ-射线照射源、Autocell40购自加拿大原子能有限公司（剂量率为1.01 Gy/min）；美国BD FAC⁃SAriaⅢ流式细胞仪；日本光电MEK-T222K全自动血液分析仪。streptavidin APC-Cy7、anti-c-kit-APC、biotin-conjugated anti-mouse CD5、anti-CD45R/B220、anti-Gr-1、anti-Mac-1α 及anti-Ter-119抗体均购自美国ebioscience公司；anti-Sca-1-PE-Cy7抗体购自美国Biolegend公司。

1.2实验动物SPF级C57BL/6小鼠72只，雄性，6～8周龄，体质量18～22 g，购自北京维通利华实验动物有限公司，合格证号：SCXK(京) 2009-0017，饲养于中国医学科学院生物医学工程研究所动物实验中心。

1.3方法

1.3.1动物分组按照随机区组法将C57BL/6小鼠分为对照组和2、4、6 Gy照射组，每组18只。2、4、6 Gy照射组进行一次性全身137Csγ-射线照射，吸收剂量分别为2、4和6 Gy，源靶距15 cm，吸收剂量率1.01 Gy/min；对照组接受假照射（即不照射）。实验过程中，所有动物在同等条件下饲养，自由饮水和摄食。

1.3.2脏器指数测定分别于照射后14、35和56 d称取小鼠体质量，断颈处死小鼠各6只，电子天平称取小鼠脾脏和胸腺的质量，计算脾脏和胸腺指数。脾脏指数=脾脏质量（mg）/体质量（g）。胸腺指数=胸腺质量（mg）/体质量（g）[6]。

1.3.3外周血常规检测小鼠眼球取血，并将血装入含k3EDTA抗凝剂的EP管中，用血细胞计数仪测定白细胞（white blood cell, WBC）计数、红细胞（red blood cell, RBC）计数、血小板（platelet, PLT）和血红蛋白含量（hemoglobin, HGB）等指标[6]。1.3.4骨髓有核细胞（bone marrow nuclear cells, BMNCs）、HSCs和HPCs数目的检测无菌分离小鼠单侧股骨，用PBS（含2%胎牛血清）将骨髓细胞冲出并进行细胞计数。取5× 106个小鼠骨髓细胞，加入生物素偶联的CD5、CD45R/B220、Gr-1、Mac-1α和Ter-119抗体，冰上孵育30 min后加入1 mL含2%FBS的PBS，400 r/min离心5 min后弃上清；加入streptavidin APC-Cy7、anti-c-kit-APC和anti-Sca-1-PE-Cy7抗体染色，用含2%FBS的PBS调整染色体积50～80 μL，冰上孵育90 min后加入1 mL含2%FBS的PBS，400 r/min离心5 min，弃上清；加入500 μL PBS重新悬浮细胞，过滤至流式管中进行流式细胞仪分析[7]。Flow Jo7.6软件分析数据，结果以每只小鼠单侧股骨BMNCs数目、HSCs数目和HPCs数目表示。

1.4统计学方法采用GraphPad Prism 5.0统计软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x ±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用Tukey′s检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1小鼠体质量和脏器指数的变化情况（1）体质量。照射组小鼠体质量较对照组均有不同程度下降，4 Gy和6 Gy照射组在照射后14 d的体质量明显低于对照组，6 Gy照射组在照射后35 d和56 d的体质量明显低于对照组（均P＜0.05）。（2）脏器指数。除6 Gy照射组在照射后35 d的脾脏指数低于对照组（P＜0.05）外，各照射组在照射后不同时点的脾脏指数与对照组差异均无统计学意义。（3）胸腺指数。6 Gy照射组在照射后不同时点的胸腺指数均低于对照组（均P＜0.05），2 Gy和4 Gy照射组胸腺指数与对照组差异均无统计学意义。见表1。

Tab. 1 Changes of body weight and organ index after different doses of137Csγ-irradiation表1不同剂量137Csγ-射线照射后小鼠体质量和脏器指数的变化情况　(n=6, x ±s)

2.2小鼠外周血血常规指标的变化情况不同剂量射线照射后，小鼠造血系统受到不同程度损伤。（1）WBC。照射后14 d，各照射组小鼠外周血WBC均低于对照组（均P＜0.05）；照射后35 d，4 Gy和6 Gy照射组低于对照组（均P＜0.05），2 Gy照射组与对照组差异无统计学意义；照射后56 d，2 Gy和4 Gy照射组小鼠外周血WBC开始恢复（均P＞0.05），6 Gy照射组仍低于照射组（均P＜0.05）。（2）RBC。照射后14 d，各照射组小鼠外周血RBC均低于对照组（均P＜0.05）；照射后35 d和56 d，各照射组与对照组差异均无统计学意义。（3）HGB。除2 Gy照射组在照射后14 d的HGB低于对照组（P＜0.05）外，各照射组在照射后不同时点与对照组差异均无统计学意义。（4）PLT。照射后14 d，各照射组小鼠PLT与对照组比较均有不同程度降低（均P＜0.05）；照射后35 d和56 d，仅6 Gy照射组低于对照组（均P＜0.05），2 Gy和4 Gy照射组与对照组差异均无统计学意义。见表2。组分别下降26.15%、93.86%和97.06%，HPCs较对照组分别下降31.68%、45.05%和79.46%；照射后35 d，6 Gy照射组BMNCs和HPCs数目均低于对照组（均P＜0.05），2、4和6 Gy照射组HSCs数目均低于对照组（均P＜0.05）；照射后56 d，6 Gy照射组BMNCs和HPCs数目低于对照组，4 Gy和6 Gy照射组HSCs数目均低于对照组（均P＜0.05），见表3、图1。

Tab. 3 Changes of number of BMNCs, HSCs and HPCs after different doses of137Cs γ-irradiation表3不同剂量射线后小鼠BMMNCs、HSCs和HPCs数目的变化情况　(n=6, x ±s)

Tab. 2 Changes of routine blood test after different doses of137Cs γ-irradiation表2不同剂量137Csγ-射线照射后小鼠外周血血常规指标的变化情况　(n=6, x ±s)

Fig.1 Phenotype analysis of mouse bone marrow cells图1小鼠骨髓细胞表型分析

2.3小鼠BMNCs、HSCs和HPCs数目的变化情况照射后，与对照组比较，照射组小鼠BMNCs、HSCs和HPCs数目均有不同程度下降。照射后14 d，2 Gy、4 Gy和6 Gy照射组BMNCs、HSCs和HPCs数目均低于对照组（均P＜0.05），BMNCs较对照组分别下降25.09%、39.93%和54.42%，HSCs较对照

3　讨论

机体受到辐射后，骨髓细胞的增殖和分裂功能受到损伤，导致血细胞来源减少，从而引起外周血象不同程度的变化[1]。HSCs是一类具有自我更新与分化能力的细胞，电离辐射可以引起HSCs损伤，导致其数目减少，体内体外自我更新及重建能力降低，进而引起骨髓的持久性损伤[2,7-8]。本研究通过测定小鼠外周血中WBC、RBC、PLT、HGB、BMNCs、HSCs和HPCs数目以研究不同剂量射线照射对小鼠造血系统的影响。

机体更新比较活跃的造血血液细胞具有较高的辐射敏感性。本研究结果显示，137Csγ-射线照射后，与对照组相比，小鼠造血系统受到不同程度损伤。外周血WBC和PLT、HGB、RBC均有不同程度的降低，其中HGB对辐射较不敏感，RBC在受照后35 d已基本恢复至正常值，可能是由于红细胞生存寿命为120 d，比其他血细胞存活时间长，并且红细胞造血功能恢复较早；WBC和PLT对辐射较敏感，6 Gy照射对小鼠外周血WBC和PLT造成较重的影响，恢复缓慢。

骨髓是对辐射高度敏感的组织，辐射引起骨髓损伤进而导致骨髓造血细胞的变化[9]。BMNCs水平可在一定程度上反映骨髓造血能力[6]。本研究结果表明，C57BL/6小鼠照射后35 d，2 Gy和4 Gy照射组小鼠BMNCs数已经基本恢复，而6 Gy照射组小鼠BMNCs数在照射后56 d仍未完全得到恢复。

HSCs具有较强的增殖能力和向特定组织即造血组织各系细胞分化的功能。研究证明成体HSCs不表达系特异性抗原Lin，即B细胞分化抗原B220、粒细胞分化抗原Gr-1、单核细胞分化抗原Mac-1、T细胞分化抗原CD4和CD8，但高水平表达干细胞抗原1（stem-cell antigen 1, Sca1)和c-Kit，简称LSK (Lin-Sca1+c-Kit+)[9]。HSCs在分化为形态上可辨认的幼稚血细胞之前，还经历了一个中间发育阶段。在这一阶段中的细胞已经丧志HSCs所特有的自我复制和多向分化的能力，它们只能沿着有限的几个方向或甚至一个方向分化。这一阶段细胞在调控因子的影响下，可进行有限的细胞增殖活动，并在增殖过程中进一步发育成熟。这一阶段的细胞称为HPCs，其细胞表面标记为Lin-Sca1-c-Kit+。本实验采用流式细胞仪分析HSCs和HPCs比例，结合Flow Jo7.6软件，即可获知不同剂量辐射对造血干/祖细胞的损伤效应。本研究结果表明，C57BL/6小鼠照射后35 d，2 Gy和4 Gy照射组小鼠HPCs数目已经基本恢复，6 Gy照射组小鼠HPCs数目在照射后56 d仍未完全得到恢复。而HSCs在受到辐射损伤后56 d，4 Gy和6 Gy照射组小鼠HPCs数目均未得到恢复，提示电离辐射对小鼠骨髓HSCs造成的损伤是持续性的。Wang等[2]研究显示，给予6.5 Gy全身照射，小鼠HSCs的损伤程度高于HPCs，且HSCs的损伤是不可逆的。Chang等[10]研究表明，1 Gy质子辐射可以引起小鼠HSCs的永久性损伤。本研究结果同以往研究结果基本一致。

本研究从低中高3个不同剂量研究造血系统不同细胞辐射敏感性的差异，结果提示小鼠外周血WBC、PLT、BMNCs和HPCs的辐射损伤在2 Gy和4 Gy剂量照射后是可以恢复的，6 Gy剂量辐射引起的损伤较严重，可能需要更长的时间才能得到恢复。2 Gy、4 Gy和6 Gy电离辐射对HSCs的损伤是持久性的，在2个月内均不能得到恢复。

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（2015-08-20收稿2015-09-25修回）

（本文编辑陈丽洁）

The difference in the radiosensitivity between hematopoietic stem and progenitor cells after different doses of137Csγ-radiation

LU Lu1, LI Deguan1, ZHANG Junling1, WANG Yueying1, MENG Aimin2
1 Institute of Radiation Medicine, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College,Tianjin Key Laboratory of Radiation Medicine and Molecular Nuclear Medicine, Tianjin 300192, China；2 Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College Corresponding Author E-mail: aiminmeng@irm-cams.ac.cn

Abstract:Objective To observe the different radiosensitivity induced by different doses of137Csγ-ray irradiation between hematopoietic stem and progenitor cells. Methods Seventy-two C57BL/6 mice were randomly divided into control group and irradiated groups (2, 4 and 6 Csγ-ray irradiation, n=18 for each group). Mice of control group received sham irradiation, and the rest accepted 2, 4 and 6 Gy137Csγ total body irradiation, respectively. After 14-day, 35-day and 56-day irradiation, the peripheral blood samples were collected by balls enucleation. The number of bone marrow nuclear cells, hematopoietic stem and progenitor cells were counted. Results The peripheral blood of irradiated mice showed significant changes in the number of white blood cells (WBC), red blood cells (RBC), platelets (PLT) and hemoglobin (HGB) in a dose-response relationship. Compared with the control group, the numbers of BMNCs and hematopoietic progenitor cells (HPCs) were significantly lower in irradiated group. At 35 d and 56 d after 6 Gy irradiation the numbers of BMNCs and HPCs were significantly lower than those of control group (P＜0.05). There were no significant differences in numbers of BMNCs and HPCs between irradiated groups (2 and 4 Gy)and control group. The number of bone marrow hematopoietic stem cells (HSCs)was significantly lower in irradiated group than that in control group after 14-d and 56-d irradiation (P＜0.05). Conclusion137Csγ-ray irradiation has some damage in mouse hematopoietic system. The damage caused by radiation is persistent to hematopoietic stem cells.

Key words:γ-ray；peripheral blood；hematopoietic stem cell；hematopoietic progenitor cell；137Cs

中图分类号：R331.2

文献标志码：A

DOI：10.11958/20150115

基金项目：国家重点基础研究发展计划（973）资助项目(2011CB964800-G)；国家自然科学基金面上项目（81372928）；天津市应用基础与前沿技术研究计划青年项目（15JCQNJC46000）；“协和青年基金资助”和“中央高校基本科研业务费专项资金资助”（3332013044）；中国医学科学院放射医学研究所发展基金（1521）

作者简介：路璐（1982），女，助理研究员，硕士，主要从事辐射损伤防护药物研究

通讯作者E-mail: aiminmeng@irm-cams.ac.cn