布南色林对H2O2引起的PC12细胞损伤的神经保护作用研究

黄海潮，巫玮，张小红，聂阳，刘经亮，周捷



布南色林对H2O2引起的PC12细胞损伤的神经保护作用研究

黄海潮1，巫玮1，张小红1，聂阳1，刘经亮1，周捷2

摘要：目的探讨布南色林对H2O2引起的大鼠嗜铬细胞瘤（PC12）细胞损伤的保护作用。方法取对数生长期PC12细胞，接种于96孔板，每孔加入终浓度为分别为0、5、10、20、40、80及160µmol·L-1的布南色林，观察不同浓度布南色林对PC12细胞增殖的影响。另取细胞，分为空白细胞对照（C）组，H2O2处理（H）组，布南色林- H2O2处理（B）组,阳性对照（维生素E- H2O2处理，E）组）。MTT法检测各组细胞的活性变化。用TUNEL法检测各组细胞凋亡情况；倒置显微镜直接观察法以及Hoechst33258染色法观察氧化损伤细胞的形态变化；生化法测定各组细胞的超氧化物歧化酶（SOD）活性以及丙二醛（MDA）含量的改变。结果合适浓度的布南色林（0～20µmol·L-1）能促进PC12细胞的生长。与C组比较，H组的细胞活性下降，凋亡指数增加（P＜0.05）；细胞碎片增多，细胞损伤明显；细胞内的SOD活性减低，MDA水平增高（P＜0.05）。与H组比较，B组的细胞活性增强，凋亡指数下降（P＜0.05）；细胞形态部分恢复；细胞内的SOD活性增强，MDA含量降低（P＜0.05）。结论布南色林对H2O2引起的神经损伤有保护作用。

关键词：创伤,神经系统；细胞凋亡；PC12细胞；神经保护；布南色林；超氧化物歧化酶；丙二醛

作者单位：1广东食品药品职业学院（邮编510520）；2中山大学肿瘤防治中心药学部

抗精神分裂症新药布南色林（Blonanserin）为高度选择性的5-羟色胺Ⅱ（5-HT2）受体和多巴胺Ⅱ（D2）受体拮抗药，能有效治疗精神分裂症阴性和阳性症状，还能有效改善患者的认知功能，不良反应较少[1-2]。研究显示，精神分裂症早期常伴有大量灰质的丢失[3]。神经解剖和影像学表明精神分裂症伴有脑室的扩大[4]、大脑颞叶体积的缩小[5]以及神经元数量的明显减少[6]。有研究证实，细胞凋亡可能参与了精神分裂症的病理过程[7-8]。利培酮、奥氮平等非典型抗精神病药对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤（PC12）细胞的氧化损伤有保护作用[9-10]。本研究旨在探讨布南色林对H2O2引起的PC12细胞损伤是否有保护作用，以期为临床用药提供参考。

1　资料与方法

1.1一般资料PC12细胞购自中国医学科学院细胞研究所；布南色林购自上海瀚香生物科技有限公司（纯度＞98%）。细胞培养瓶、6孔板、96孔板（corning公司）；DMEM培养基、马血清（Gibco公司）；胎牛血清（FBS，杭州四季青公司）；胰蛋白酶（Amresco公司）；Triton-X-100、噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜(DMSO，Sigma公司）；pH 7.2的磷酸盐缓冲液（PBS，杭州吉诺公司）；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒（南京建成生物有限公司）。

1.2细胞培养将PC12细胞接种于含有5%FBS和5%马血清的DMEM培养基，于37℃、饱和湿度、5%CO2细胞培养箱中培养24 h后换液1次，取对数生长期PC12细胞进行实验。

1.3不同浓度布南色林对PC12细胞增殖的影响取实验待用细胞，用0.25%胰酶消化，以4 000个/孔接种于96孔板，每孔加入终浓度分别为0、5、10、20、40、80及160µmol·L-1的布南色林。并设空白调零孔（只加DMEM培养基，不加细胞）。每组均设5个复孔，培养48 h，每孔加入5 g/L MTT 10 µL，37℃继续培养4 h，弃上清液，每孔加入DMSO 100µL，用酶标仪检测各孔在490 nm波长下的光密度（OD）值。

1.4 PC12细胞活性及细胞凋亡情况分析（1）细胞活性检测。取对数生长期细胞，分空白细胞对照（C）组；200µmol·L-1H2O2处理（H）组；实验（B）组，预先加入合适浓度布南色林处理12 h，再加入200µmol·L-1H2O2处理12 h；阳性对照维生素E-H2O2处理（E）组，预先加入浓度为200µmol·L-1维生素E处理12 h，再加入200µmol·L-1H2O2处理12 h。每组均设5个复孔，每孔加入5 g/L MTT 10µL，37℃继续培养4 h，弃上清液，每孔加入DMSO 100µL，用酶标仪检测各孔在490 nm波长下的OD值，实验重复3次。计算细胞活性，细胞活性（%）=OD药物组/OD空白细胞组×100%。（2）细胞凋亡情况分析。实验分组如（1）。按4×104个/mL密度接种于6孔板，经TUNEL处理后，在荧光显微镜下呈绿色荧光的为阳性。在200倍下，任选3个视野进行细胞计数，每个视野中计数100个细胞，以阳性细胞数为凋亡指数。

1.5布南色林对H2O2引起PC12细胞损伤的形态观察按1.4进行实验分组，药物作用后，倒置显微镜观察细胞形态；再加入4%的多聚甲醛固定，用10 mg·L-1的Hoechst 33258对细胞进行染色10 min后，用倒置荧光显微镜观察细胞形态。

1.6布南色林对PC12细胞中SOD、MDA含量的影响细胞接种于6孔板，实验分组如1.4。药物处理后，小心吸去原培养液，用PBS洗2遍，每孔加入0.1 mol·L-1的PBS和0.05 mol·L-1的EDTA（pH 8.0）2 mL，再加入100µL 1%的Triton-X-100，将培养板置振荡器振荡1 min使之溶解，加入25%的H3PO4溶液200µL，12 000 r/min于4℃离心1 h，取上清液，按试剂盒说明书测定SOD活性和MDA含量。

1.7统计学方法采用SPSS 18.0软件对数据进行统计分析。符合正态分布的计量数据以x ±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1布南色林对PC12细胞增殖的影响浓度分别为0、5、10、20、40、80、160µmol·L-1的布南色林作用PC12细胞后，细胞OD值分别为0.426±0.019、0.428±0.012、0.432±0.005、0.446±0.013、0.378± 0.012、0.182±0.010及0.090±0.011（F=527.215，P＜0.05），其中0、5及10µmol·L-1组间差异无统计学意义外，其他组间差异均有统计学意义。浓度 40 µmol·L-1后呈逐渐降低趋势（P＜0.05）。

2.2各组细胞活性和凋亡指数比较与C组比较，各实验组细胞的活性下降，凋亡指数增加；与H组比较，B组和E组的细胞活性增强，凋亡指数下降（均P＜0.05），见表1。

Tab.1 Comparison of cell viability, apoptotic rate of PC12 cells, MDA and SOD between four groups表1各组细胞活性、凋亡指数、MDA和SOD水平比较（n=3，x ±s）

2.3 PC12细胞损伤的形态观察C组细胞呈不规则多角形，Hoechst染色显示正常PC12细胞核呈暗蓝色的椭圆形，细胞碎片呈亮蓝色，细胞损伤明显；与C组比较，H组中细胞轮廓变得模糊，细胞呈不完整状态，细胞碎片明显增多，细胞损伤更明显；与H组比较，E组和B组细胞贴壁生长明显增多，细胞形态部分恢复，在B组和E组中部分细胞出现暗蓝色的正常细胞核，见图1。

2.4各组SOD活性以及MDA水平比较与C组比较，H组MDA水平增加、SOD活性减少；与H组比较，B组和E组MDA水平降低、SOD活性增加（均P＜0.05），见表1。

3　讨论

3.1布南色林对PC12细胞增殖的影响目前，在精神分裂症病因中，神经发育障碍假说获得较多支持，认为在神经发育的过程中，某些脑区神经元的凋亡损伤、神经细胞的萎缩和数量减少，从而导致的神经元的排列、连接出现异常是精神分裂症的病理基础[7]。本研究结果显示，0、5及10µmol·L-1组间细胞增殖情况差异无统计学意义，其他组间差异均有统计学意义， 40µmol·L-1后呈逐渐降低趋势，表明布南色林＜20µmol·L-1，其对细胞的增殖影响不明显，当药物浓度达到20µmol·L-1时，细胞增殖增强；布南色林在较高浓度（ 40µmol·L-1）对PC12细胞生长有抑制作用，提示过量抗精神分裂药物对神经细胞有损伤作用。

3.2布南色林对氧化损伤PC12细胞活性的影响在精神分裂症患者中神经细胞的凋亡损伤往往与细胞的氧化应激水平有关。研究认为，患有精神分裂症的患者血中的各种抗氧化物质及脂质过氧化物的水平存在异常，可能机制为患者脑内的自由基生成过多，或者是生理性清除机制有所减弱，从而导致脂质过氧化反应增多，神经毒性增强，引起神经元的凋亡损伤[11-12]。在布南色林对PC12细胞氧化损伤的结果中提示，合适浓度（20µmol·L-1）的布南色林能减轻H2O2引起PC12细胞的凋亡情况，并减少细胞氧化损伤程度。为了进一步证实其抗氧化的效果，通过测定损伤PC12细胞内的SOD以及MDA水平变化来明确布南色林抗氧化损伤效果。SOD是神经元内抗氧化系统中重要的生物酶，在一定程度上可保护细胞免受自由基的损害，其含量的高低通常反映机体抗氧化能力的强弱。MDA是神经元脂质过氧化的产物，可反映机体内的脂质过氧化程度以及自由基水平。本研究显示，与C组比较，H组MDA水平增加、SOD活性减少；与H组比较，B组和E组MDA水平降低、SOD活性增加，表明浓度为20 µmol·L-1布南色林能降低H2O2引起PC12细胞损伤中MDA水平以及提高SOD的活性，其作用效果较阳性对照药（维生素E）弱，而维生素E是被证实能够阻断细胞膜脂质过氧化，使细胞、组织、器官免受自由基攻击，是研究氧化损伤中常用的阳性对照药，提示布南色林对PC12细胞的保护作用可能与改变细胞内的自由基水平有关，这与相关研究相似[11-13]。综上所述，布南色林作为第二代抗精神分裂症药，能减轻氧化应激引起的损伤，有神经保护作用。

对于其如何改变细胞内氧化应激水平以及对细胞内相关离子水平变化的影响尚待进一步深入研究。

（图1见插页）

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（2015-09-14收稿2015-11-06修回）

（本文编辑陆荣展）

实验研究

Neuroprotective effects of blonanserin on H2O2-induced injury in PC12 cells

HUANG Haichao1, WU Wei1, ZHANG Xiaohong1, NIE Yang1, LIU Jingliang1, ZHOU Jie2
1 Guangdong Food and Drug Vocational College, Guangzhou 510520, China;
2 Department of pharmacy, SUN YAT-SEN University Cancer Center Corresponding Author E-mail：Wuweide2009@163.com

Abstract：Objective To explore neuroprotective effects of blonanserin on H2O2-induced injury in PC12 cells. Meth⁃ods PC12 cells were divided into four groups: control group (C group), H2O2-treated group (H group), blonanserin pretreat⁃ed group (B group) and positive control group (vitamin E- pretreated, E group). The effects of different concentrations of blonanserin (0, 5, 10, 20, 40, 80 and 160µmol·L-1) on cell proliferation in PC 12 cells were observed. MTT assay was used to detect the cell activity of different groups. The apoptotic rates of different groups were measured by TUNEL assay. The mor⁃phological changes were observed usinginverted microscope and Hoechst 33258 staining. The superoxide dismutase (SOD)vi⁃ability and malondialdehyde (MDA) levels were detecded by biochemical methods in four groups. Results The appropriate concentration of blonanserin (0-20µmol·L-1)can promote the growth of PC12 cells. Comparingwith the C group, the apoptot⁃ic rate and MDA level were increased in group H, while the cell viability and the SOD viability were decreased obviously (P＜0.05). Compared with H group, the cell viability, SOD viability were significantly increased, while the MDA level and apoptotic rate were decreased (P＜0.05). Conclusion Blonanserin shows neuroprotective effect on H2O2-induced injury in PC12 cells.

Key words:trauma, nervous system；apoptosis; PC12 cell; neuroprotective; Blonanserin; SOD; MDA

中图分类号：R749.3，R749.05

文献标志码：A

DOI：10.11958/20150159

基金项目：广东省医学科学技术研究基金（B2013071）

作者简介：黄海潮（1982），男，实验师，硕士研究生，主要从事神经药理研究

通讯作者E-mail：Wuweide2009@163.com