壳斗科植物种子的多酚类含量及抗氧化能力*

王亚凤，黄永林，刘金磊，颜小捷，陈月圆，杨子明，何瑞杰，李典鹏

(广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所，广西植物功能物质研究与利用重点实验室，广西桂林　541006)

壳斗科植物种子的多酚类含量及抗氧化能力*

王亚凤，黄永林**，刘金磊，颜小捷，陈月圆，杨子明，何瑞杰，李典鹏

(广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所，广西植物功能物质研究与利用重点实验室，广西桂林541006)

摘要：【目的】测定青冈栎Cyclobalanopsis glauca(Thunb.) Oerst.、饭甑青冈Cyclobalanopsis fleuryi (Hickel.et A.Camus) Chun ex Q.F.Zheng、大叶栎Quercus griffithii Hook.f.et Thoms ex Miq.、栲Castanopsis fargesii、椆木Lithocarpus thalassica (Hance) Rehd.种子中的多酚含量，评价其提取物的抗氧化能力，并分析多酚含量与抗氧化能力的关系。【方法】采用Folin-酚法测定多酚含量，通过DPPH·和ABTS·自由基清除法评价种子提取物的抗氧化能力。【结果】在选取的5种壳斗科植物种子中，饭甑青冈的多酚含量最高(14.16%)，其次为大叶栎(10.89%)，栲的含量最低(0.44%)；各提取物均表现出良好的抗氧化能力，其中青冈栎的半清除率质量浓度IC50均优于抗坏血酸(Vc)，饭甑青冈IC50与Vc相当。【结论】青冈栎与饭甑青冈种子提取物可作为天然抗氧化剂应用于保健品、化妆品乃至药品等行业。

关键词：壳斗科总酚含量测定抗氧化能力

0引言

【研究意义】壳斗科植物因其种子均有包含种子的壳斗而得名，主要产于亚洲东南部及南部，中国分布的有栗属(Castanea)、锥属(Castanopsis)、水青冈属(Fagus)、柯属(Lithocarpus)、栎属(Quercus)、青冈属(Cyclobalanopsis)和三棱栎属(Trigonobalanus)等7属，约300种。除新疆维吾尔自治区有引种外，其它各省均为自然分布。壳斗科植物多为常绿或落叶乔木，稀灌木，是山地水源林的重要成分及主要用材树种[1]。【前人研究进展】现有的研究表明壳斗科植物树叶、树皮均富含多酚类成分，并具有很好的抗氧化活性[2-8]。关小丽等[4]对8种壳斗科植物叶中总酚的含量进行测定并进行抗氧化能力检测，表明研究的8种壳斗科植物叶中均含有多酚类成分并具有较好的抗氧化能力。Huang等[5]对大叶栎新鲜叶子提取物进行化学成分分离，得到大量多酚类化合物，并对主要成分进行脂肪酶抑制活性研究和ORAC值测定。Huang等[6-8]还从苦槠叶、米槠叶中分离得到多种多酚物质。【本研究切入点】目前对于壳斗科植物种子的研究主要集中在总脂肪、蛋白质、还原糖、淀粉、果胶等营养成分的比较分析上，还未见有关化学成分及药理活性方面的公开报道[9]。因此本文从种子的化学成分入手，研究其应用价值。【拟解决的关键问题】测定种子中多酚类成分的含量、类型及其抗氧化能力，为全面开发利用壳斗科植物资源提供科学依据。

1材料与方法

1.1仪器

JA2003N电子天平(上海菁海仪器有限公司)；AS5150A超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；N-1100旋转型蒸发仪(东京理化)；CA-1111冷却水循环(东京理化)；十两装高速中药粉碎机(浙江瑞安市百信药机器械厂)；TDZ4A-WS低速台式离心机(湘仪离心机有限公司)；电子恒温不锈钢水浴锅(上海宜昌仪器纱筛厂)；RT-9100半自动生化分析仪(深圳雷杜生命科学股份有限公司)。

1.2试剂

没食子酸对照品(中国药品生物制品检定所)；2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS，美国Sigma公司)；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，美国Sigma公司)；福林酚试剂(GOLD WHEAT)；抗坏血酸(Vc，中国药品生物制品检定所)；纯净水；其它试剂均为分析纯。

1.3样品

实验样品经广西植物研究所吕仕洪副研究员鉴定分别为青冈栎Cyclobalanopsis glauca(Thunb.) Oerst.、饭甑青冈Cyclobalanopsis fleuryi (Hickel.et A.Camus) Chun ex Q.F.Zheng、大叶栎Quercus griffithii Hook.f.et Thoms ex Miq.、栲Castanopsis fargesii、椆木Lithocarpus thalassica (Hance) Rehd.的种子。凭证标本保存于广西植物功能物质研究与利用重点实验室。

1.4方法

1.4.1含量测定方法

有关对照品溶液的配制以及标准曲线的制作均参考文献[10]。

1.4.1.1对照品溶液的配制

精密称取干燥至恒重的没食子酸对照品10.5 mg，置于100 mL容量瓶中，用50%(V/V)甲醇溶解并定容至刻度并摇匀，即得0.105 g·L-1的没食子酸对照品溶液。

1.4.1.2标准曲线的建立

分别精确吸取50 μL、100 μL、150 μL、200 μL、250 μL、300 μL对照品溶液于具塞试管中，加入蒸馏水稀释至1 mL(同时以1 mL蒸馏水作对照)，然后加入0.5 mL Folin-Ciocalteu试剂摇匀，静置10 min后分别加入1.5 mL 0.075 g/mL的碳酸钠溶液及2 mL蒸馏水，摇匀，置于40℃水浴锅中反应1 h，冷却，于760 nm波长处测定样品吸光值。以吸光度(X)为横坐标，所测定样品的含量(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=0.0472X-0.0008(R2=0.9994)，表明在本实验条件下没食子酸在0～31.5 μg具有良好线性关系。

1.4.1.3供试品溶液的制备

将真空干燥的种子粉碎，过40目筛，精密称取粉末1 g，按1∶25的料液比加入80%(V/V)的乙醇超声提取2次，每次30 min，过滤，合并滤液并转移至100 mL容量瓶中，用80%(V/V)的乙醇定容至100 mL，摇匀，即得到供试品溶液。

1.4.1.4总多酚含量测定

分别精密取壳斗科植物种子样品各3份，按照1.4.1.3节中方法进行供试品溶液的制备，按照1.4.1.2节中方法显色及测定吸光度值，并由线性回归方程计算出样品中多酚的含量，并计算出各样品中多酚类物质的百分含量。

1.4.1.5方法学验证

(1)精密度实验

精确吸取一定量青冈栎种子供试品溶液，按1.4.1.2节中方法显色，在760 nm波长处进行吸光度测定，连续测量6次，测得数据的RSD为0.028%，表明仪器精密度良好。

(2)稳定性实验

精确吸取一定量青冈栎种子供试品溶液，按1.4.1.2节中方法显色，测量240 min内吸光度值，每30 min测一次，测得数据的RSD为0.46%，表明该样品在显色后240 min内稳定性良好。

(3)重现性实验

参考文献[4，11]，分别称取一定量青冈栎种子粉末，按1.4.1.3节中方法制备供试品溶液6份，从每份供试品溶液中精确吸取一定量的溶液，按1.4.1.2节中方法显色，在760 nm波长处测定吸光度值，可计算出青冈栎种子中多酚类物质的含量为5.11%，其RSD为0.44%，表示该提取方法重复性良好。

(4)加样回收率实验

精密称取已知多酚含量样品6份，按1.4.1.3节中方法制备供试品溶液，再分别吸取一定量的供试品溶液，并加入一定量的对照品，按1.4.1.2节中方法显色并测定吸光度值，计算平均加样回收率为100.87%，RSD为0.66%，说明该方法具有较高的准确性。

1.4.2抗氧化能力测定

实验方法参考文献[11-15]，有所改动。

1.4.2.1供试品溶液的制备

将真空干燥的种子粉碎，过40目筛，精密称取粉末10 g，按1.4.1.3节中方法进行提取，过滤，合并滤液并减压浓缩干燥，即得供试样品，然后通过1.4.1.2节中的方法测定提取物中多酚含量。

1.4.2.2DPPH·自由基清除实验

精密吸取不同浓度的样品溶液0.5 mL于具塞试管中，加入0.5 mL DPPH乙醇溶液(0.394 g·L-1)混匀(空白组用溶剂代替样品溶液，对照组用溶剂代替DPPH溶液)。以上3组在37℃水浴中放置30 min，于517 nm处测定其吸光度。按照同样方法以Vc作阳性对照，按照如下公式计算DPPH·自由基的清除率，并计算半清除率质量浓度(IC50)，

DPPH·清除率=[A空白-(A样品-A对照)]/A空白×100%。

1.4.2.3ABTS·自由基清除实验

精密吸取不同浓度的样品溶液200 μL于具塞试管中，然后加入2 mL ABTS溶液混匀(空白组用溶剂代替样品，对照组用溶剂代替ABTS溶液)。以上3组在室温下避光放置30 min，于734 nm处测定吸光度。按照同样方法以Vc作阳性对照，按照如下公式计算ABTS·自由基的清除率，并计算半清除率质量浓度(IC50)，

ABTS·消除率=[A空白-(A样品-A对照)]/A空白×100%。

2结果与分析

2.1总多酚含量

通过对壳斗科植物种子中多酚类含量测定结果(表1)可知，壳斗科植物种子中均含有多酚类成分，饭甑青冈种子中的总多酚含量最高(14.16%)，其次为大叶栎(10.89%)，栲含量最低(0.44%)，各植物种子间多酚类物质含量差异大。

表1不同样品多酚含量(n=3)

Table 1Polyphenol content of samples(n=3)

样品Samples多酚含量Polyphenolcontent(%)RSD(%)青冈栎种子SeedsofCyclobalanopsisglauca5.111.43饭甑青冈种子SeedsofCyclobalanopsisfleuryi14.161.56大叶栎种子SeedsofQuercusgriffithii10.891.92栲种子SeedsofCastanopsisfargesii0.442.10椆木种子SeedsofLithocarpusthalassica1.311.04

2.2抗氧化能力

2.2.1DPPH·自由基清除能力

在同一质量浓度下，经DPPH·自由基清除实验检测，吸光度越小说明样品消除能力越强。如表2所示，在一定质量浓度范围内，样品质量浓度与DPPH·清除能力具有明显的量效关系。青冈栎种子、饭甑青冈种子提取物样品的DPPH·清除能力与Vc相当，大叶栎种子提取物的DPPH·清除能力最弱，这可能与植物的多酚类物质种类有关。

2.2.2ABTS·自由基清除能力

在一定质量浓度下，经ABTS·自由基清除实验检测，吸光度越小说明样品消除能力越强。由表3可知，在一定质量浓度范围内，样品质量浓度与ABTS·清除能力具有明显的量效关系。样品中除椆木种子提取物外，其他提取物均表现出较强的ABTS·清除能力，其中青冈栎种子提取物的ABTS·清除能力最强，在同等质量浓度下青冈栎种子提取物IC50优于Vc，饭甑青冈IC50与Vc相当。

表2样品清除DPPH·自由基能力

Table 2The capability of DPPH· radical scavenging of samples

样品SamplesIC50(mg·ml-1)青冈栎种子SeedsofCyclobalanopsisglauca0.38饭甑青冈种子SeedsofCyclobalanopsisfleuryi0.43大叶栎种子SeedsofQuercusgriffithii4.88栲种子SeedsofCastanopsisfargesii1.10椆木种子SeedsofLithocarpusthalassica3.84Vc0.41

表3样品清除ABTS·自由基能力

Table 3The capability of ABTS· radical scavenging of samples

样品SamplesIC50(mg·ml-1)青冈栎种子SeedsofCyclobalanopsisglauca0.13饭甑青冈种子SeedsofCyclobalanopsisfleuryi0.61大叶栎种子SeedsofQuercusgriffithii2.17栲种子SeedsofCastanopsisfargesii1.96椆木种子SeedsofLithocarpusthalassica4.97Vc0.31

3结论

通过对壳斗科植物种子中多酚类含量的测定可知，饭甑青冈种子中的总多酚含量最高(14.16%)，其次为大叶栎(10.89%)，栲含量最低(0.44%)，各植物种子间多酚类物质含量差异比较大。综合2种抗氧化能力试验结果表明，青冈栎种子提取物的还原能力均高于对照品Vc，饭甑青冈种子提取物与对照品Vc相当。因此，壳斗科植物中，青冈栎与饭甑青冈种子提取物可作为天然抗氧化剂应用于保健品、化妆品乃至药品等行业。

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(责任编辑：米慧芝)

Content and Antioxidant Capacity of Polyphenols from the Seeds of Fagaceae Plants

WANG Yafeng,HUANG Yonglin,LIU Jinlei,YAN Xiaojie,CHEN Yueyuan,Yan Ziming,HE Ruijie,LI Dianpeng

(Guangxi Key Laboratory of Functional Phytochemicals Research and Utilization,Guangxi Institute of Botany,Guangxi Zhuang Autonomous Region and the Chinese Academy of Sciences，Guilin，Guangxi，541006，China)

Abstract:【Objective】The content of polyphenols from the seeds of Cyclobalanopsis glauca(Thunb.) Oerst.,Cyclobalanopsis fleuryi (Hickel.et A.Camus) Chun ex Q.F.Zheng,Quercus griffithii Hook.f.et Thoms ex Miq.,Castanopsis fargesii and Lithocarpus thalassica (Hance) Rehd.was determined,antioxidant capacities of their extract were compared,and the relationship between the content of polyphenols and antioxidant capacity was analyzed.【Methods】The content of polyphenols was determined by the method of Folin-phenol,and antioxidant capacities of their extract were compared by DPPH· and ABTS· radical scavenging.【Results】The content of polyphenols from C.fleuryi was the highest (14.16%),followed by Q.griffithii(10.89%),and C.fargesii was the lowest (0.44%),and all extracts showed good antioxidant capacity.The IC50value of C.glauca was better than that of Vc,and the IC50of C.fleuryi was similar to that of Vc.【Conclusion】The extracts from the seeds of C.glauca and C.fleuryi could be used in health care products, cosmetics and even pharmaceuticals.

Key words:Fagaceae，polyphenols，content determination，antioxidant capacity

收稿日期：2015-11-12

作者简介：王亚凤 (1990-)，女，硕士研究生，主要从事天然产物化学研究。

中图分类号：TS255.1

文献标识码：A

文章编号：1005-9164(2016)02-0180-04

修回日期：2016-01-18

*广西自然科学基金项目(2014GXNSFCB118001)，中国科学院“西部之光”人才培养计划项目(科发人字[2013]165号)，广西科学院基本科研业务费项目(15YJ22ZWS22)，广西植物功能物质研究与利用重点实验室开放基金项目(ZRJJ2013-7，ZRJJ2014-1)和广西壮族自治区八桂学者专项经费项目资助。

**通信作者：黄永林(1974-),男，博士，研究员，硕士生导师，主要从事天然产物化学及开发利用研究,E-mail:hyl@gxib.cn。

广西科学Guangxi Sciences 2016,23(2):180～183,188

网络优先数字出版时间：2016-03-15

网络优先数字出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1206.G3.20160315.1515.022.html