闽西地区猪丹毒杆菌的分离及生物特性鉴定

张　敏，戴爱玲，2，孙艳发，李晓华，2，杨小燕，2，黄美璇（.龙岩学院生命科学学院，福建龙岩36402；2.福建省生猪疫病防控工程技术研究中心，福建龙岩36402）



闽西地区猪丹毒杆菌的分离及生物特性鉴定

张敏1，戴爱玲1，2，孙艳发1，李晓华1，2，杨小燕1，2，黄美璇1
（1.龙岩学院生命科学学院，福建龙岩364012；2.福建省生猪疫病防控工程技术研究中心，福建龙岩364012）

摘要：为确诊福建省龙岩市范围内4个养猪场疑似猪丹毒病例，从病猪脏器中分离、纯化细菌，并进行生物特性鉴定。根据其培养特性、形态特征、生化试验及PCR鉴定，确定为猪丹毒杆菌。16S rRNA基因测序结果表明，4株分离株16S rRNA序列全部相同，与GenBank中NR_074878_Fujisawa、NR_040871_DSM_14972、NR_113036_JCM_8533、NR_04083-7_ATCC 19414同源性为98.7%。药敏试验结果显示，4株分离株对阿莫西林、头孢噻呋、替米考星高度敏感；对庆大霉素、恩诺沙星产生耐药；对林可霉素、泰妙菌素、氟苯尼考、土霉素敏感性存在差异，其中LY-WP株对林可霉素耐受，LY-CT株对土霉素耐受。

关键词：猪丹毒杆菌；分离；鉴定；闽西地区

猪丹毒是由猪丹毒杆菌引起的一种急性、热性、人兽共患传染病，猪感染后出现皮肤疹块、关节炎和败血症，人感染后表现为类丹毒症状。上世纪末猪丹毒位列中国养猪业3大传染病之一，之后随着养猪生产的不断规范化，急性典型性病例显著减少。近年来福建、安徽、江西、广东等省不断出现猪丹毒散发报道，猪丹毒呈现卷土重来之势。

2014年4-7月龙岩学院先后接诊4个猪场疑似猪丹毒病例。本文对疑似病例病料进行细菌分离，对分离到的疑似菌株进行常规的染色鉴定、生化鉴定、16S rRNA基因序列分析，确定为猪丹毒杆菌，并通过药敏试验掌握其耐药情况，报告如下。

1　材料与方法

1.1病料来源无菌采取急性死亡猪只心脏、肝脏、肺脏、脾脏组织。

1.2主要试剂胰蛋白大豆肉汤（TSB），购自北京希凯创新科技有限公司；生化鉴定管、药敏纸片，购自杭州天和微生物试剂有限公司；胎牛血清（FBS），购自杭州四季青生物工程材料有限公司；PCR Taq Mix、2 000 bp Marker、琼脂糖、pMD18-T载体、DH5α，购自宝生物工程（大连）有限公司；PCR产物回收试剂盒、质粒提取试剂盒，购自上海生工生物工程技术服务有限公司；其他常规试剂由福建省龙岩学院生命科学学院提供。

1.3引物引用文献[2]报道引物，P-up：5′-TGA⁃CATACCGCGCAAAAGCA-3′；P-down：5′-GGCTCC CTCCTAGTAAACTA-3′。由上海华津生物工程技术服务有限公司合成。

1.4细菌分离纯化将病料分别接种于5% FBS-TSA平板，37℃恒温培养24 h，挑取表面光滑、针尖大小的圆形单个菌落进行革兰染色，镜检，观察其形态特征；再分别挑取疑似单个菌落接种于5% FBS-TSA平板，37℃恒温箱内进行纯培养。

1.5生化试验分离菌株的纯培养物接种于糖发酵培养基中，37℃恒温培养24 h～48 h，观察发酵情况；另将其接种于明胶培养基中，置于20℃培养，观察5 d。

1.6细菌PCR鉴定采用CTAB/NaCl方法提取细菌基因组DNA作为PCR模板。PCR反应体系为：2×PCR Taq Mix 12.5 μL，引物P-up/P-down各1 μL，模板DNA 1 μL，加灭菌超纯水至25 μL；PCR反应条件为：94℃，5 min；94℃、30 s，55℃、30 s，72℃、30 s，30个循环；72℃，10 min；同时设立阴性对照。取PCR产物5 μL加入上样缓冲液后进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后，用凝胶成像仪观察并记录结果。

1.7PCR产物的克隆、测序及序列分析回收PCR扩增目的片段，连于pMD18-T载体，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，提取质粒。将质粒送上海华津生物工程技术服务有限公司测序。运用DNAStar软件与GenBank公布的猪丹毒杆菌16S rRNA基因进行序列分析。

1.8药敏试验将纯培养菌液稀释100倍后均匀涂布于5%FBS-TSA表面，用无菌镊将阿莫西林、头孢噻呋、林可霉素、泰妙菌素、替米考星、庆大霉素、恩诺沙星、氟苯尼考、土霉素药敏纸片紧贴于琼脂表面，37℃恒温培养，18 h后观察结果。

2　结果

2.1细菌的形态特征经过纯培养先后得到4株分离菌株，分别命名为LY-WP株、LY-CT株、LYXL株、JX-RJ株。在5%FBS-TSA平板上长出针尖大小菌落、灰白色、透明、圆形、表面光滑。细菌革兰染色阳性，呈现长短不一杆状，甚至长丝状，无芽孢和荚膜，见图1。

图1　猪丹毒分离株革兰染色结果（10×100）

2.2细菌生化鉴定结果生化鉴定管37℃培养48 h后，观察到4株分离株均能发酵乳糖、葡萄糖；但不能发酵甘露醇、蔗糖、麦芽糖、阿拉伯糖。明胶穿刺经20℃培养5 d后，4株菌株均可观察到细菌沿穿刺线呈试管刷状生长，不液化明胶。

2.3细菌PCR鉴定结果对纯培养的分离株进行PCR扩增，被检菌株均在472 bp处出现特异性条带，片段大小与预期一致（见图2）。

图2　16S rRNA基因PCR扩增结果M：Marker；1：LY-WP株；2：LY-CT株；3：LY-XL株；4：JX-RJ株；5：阴性对照

2.4分离株16S rRNA基因序列分析结果将4株分离株PCR产物测序结果进行比对，扩增序列完全相同。采用NCBI网站中的BLAST工具，将分离菌株16S rRNA与GenBank中的序列进行比较，分离株16S rRNA与GenBank中NR_074878_Fujisawa、NR_040871_DSM_14972、NR_113036_JCM_8533、NR_ 040837_ATCC 19414同源性为98.7%，（见图3）。

2.5药物敏感性试验结果对4株猪丹毒杆菌分离株进行药敏试验，结果显示，4株分离株均对阿莫西林、头孢噻呋、替米考星高度敏感；对庆大霉素、恩诺沙星产生耐药；而对林可霉素、泰妙菌素、氟苯尼考、土霉素敏感性存在差异，其中LYWP株对林可霉素耐受，LY-CT株对土霉素耐受。

3　讨论

近年来，规模化猪场重视猪瘟、猪伪狂犬病、猪繁殖与呼吸综合征等病毒病的防控，放松了对细菌病的警惕，猪丹毒呈现死灰复燃趋势，我国各省均有不同程度散发病例。

福建省是养猪大省，龙岩市位于闽西地区，是福建省生猪出栏和猪肉产品的重要基地之一。2014年4-7月龙岩学院先后接诊4例疑似猪丹毒病例。通过细菌分离得到灰白色、透明、针尖大小菌落，革兰染色为阳性杆菌。纯培养之后检测了其生化特性，基本符合猪丹毒杆菌的生物学特性，但与国内报道福建分离株存在部分差异，如车勇良等报道的福建分离株不能发酵葡萄糖[3]，而本试验4株分离株均能发酵葡萄糖。采用PCR技术进一步鉴定，在472 bp处出现特异性目的条带。对扩增到的16S rRNA片段进行序列分析，其与GenBank中报道的NR_074878_Fujisawa、NR_040871_DSM_14972、NR_113036_JCM_8533、NR_040837_ATCC 19414同源性为98.7%，说明核苷酸保守性较好且稳定。

作为细菌性猪病，猪丹毒很容易用抗生素控制住，但易产生耐受现象。药敏试验结果表明，4株分离株对头孢类药物阿莫西林、头孢噻呋仍然高度敏感，与国内相关文献报道基本一致[4-5]；对氨基糖苷类抗生素庆大霉素耐受，与陆萍[6]、薛辉[7]报道一致；LY-WP株对林可霉素耐受，LYCT株对土霉素耐受，与邹垚[8]报道一致。

参考文献：

[1] Zhang A，Xu C，Wang H，et al . Presence and new genetic envi⁃ronment of pleuromutilin-lincosamide-streptogramin A resistance gene lsa（E）in Erysipelothrix rhusiopathiae of swine origin[J].Vet⁃erinary microbiology，2015，177（1）：162-167.

[2]谭侃侃.丹毒丝菌的分离鉴定及其SpaA-N蛋白和lipo蛋白的免疫原性分析[D].长沙：湖南农业大学，2011.

[3]车勇良，陈如敬，王隆柏，等.猪丹毒杆菌的分离鉴定及其SpaA基因的遗传变异分析[J].中国兽医学报，2011，31（11）：1591-1593.

[4]金璐娟.一株猪丹素杆菌的分离与鉴定[J].黑龙江畜牧兽医，2007（10）：87-88.

[5]何世成，谈志祥，刘道新，等.3株猪红斑丹毒丝菌湖南株的分离与鉴定[J].中国畜牧兽医，2011，38（5）：155-158.

[6]陆萍，黄晓慧，李春芬，等.安徽部分地区猪丹毒杆菌的分离鉴定及生物学特性研究[J] .微生物学通报，2014，41（9）：1822-1828.

[7]薛辉，秦树英，於庆雄，等.广西猪丹毒杆菌分离鉴定及生物学特性研究[J].养猪，2014（6）：97-100.

[8]邹垚，朱晓明，苑文涛，等.1株猪丹毒杆菌的分离与鉴定[J].畜牧与兽医，2015，47（2）：11-14.

中图分类号：S852.65+1

文献标志码：A

文章编号：0529-6005（2016）05-0045-02

收稿日期：2015-11-05

作者简介：张敏（1983-），女，讲师，博士，主要从事动物病原检测，E-mail：zhangminshiwo@163.com

通讯作者：戴爱玲，E-mail：ailing114@163.com