骨髓间充质干细胞对大鼠肺纤维化的抑制作用

阳成成，吴晓梅

骨髓间充质干细胞对大鼠肺纤维化的抑制作用

阳成成，吴晓梅

哈尔滨医科大学附属第二医院(哈尔滨 150086)，E-mail：344643928@qq.com

摘要：目的分析大鼠气管内注入博来霉素(BLMS)后，观察不同时间点移入骨髓间充质干细胞(MSC)的分化行为，分析细胞因子表达规律及其与病理变化的相关性，确定MSC移植治疗实验性肺纤维化大鼠的最佳时间窗及标准，旨在为临床上干细胞移植治疗肺纤维化的时机提供可靠参考依据。方法体外分离和培养雄性Wistar大鼠的MSC。将60只雌性Wistar 大鼠随机分为4组：A组为生理盐水对照组，气管内注入PBS50 μL；B组为博来霉素模型组，向气管内注入BLMS 5 mg/kg；C组气管内注入BLMS后立即尾静脉注射移植MSC 1×107/mL，200 μL；D组气管内注入BLMS 14 d后移植MSC 1×107/mL，200 μL。于实验7 d、14 d、28 d(D组于28 d)分别处死大鼠5只，取肺组织病理切片行HE及Masson染色，观察肺部炎症和纤维化情况及羟脯氨酸(HYP)含量测定；提取肺组织通过聚合酶链反应( PCR ) 检测雄性鼠的性别决定基因(SRY)；提取肺组织免疫组织化学法检测转化生长因子-β1(TGF-β1)蛋白表达。结果病理切片观察：B组第7天肺泡炎最明显，28 d时肺纤维化最严重，与其他3组比较有统计学意义(P<0．05或P<0．01)；C组、D组肺泡炎及肺纤维化程度均较B组显著减轻(P<0．05)，但仍较A组严重(P<0．05或P<0．01)，其中D组较C组严重(P<0．05)。Y染色体性别决定区SRY基因的检测：A组及B组检测不到SRY基因，但C组和D组各时间点均能检测到SRY基因。 HYP含量：B组第7天HYP含量开始升高，28 d达到最高峰，高于其他3组(P<0．05或P<0.01)，与A组相比各时间点HYP含量的差异均具有统计学意义(P<0.01)；C组与D组大鼠HYP含量均呈低水平升高趋势，造模后7 d、14 d、28 d HYP含量均显著低于B组(P<0.05)。TGF-β1：B组TGF-β1在14 d时表达最高，28 d时逐渐下降，各组之间比较均有统计学意义(P<0．05)。结论气管内注入博来霉素可成功复制大鼠肺纤维化模型；MSC可减轻肺泡炎、肺纤维化的程度；MSC到达损伤肺后可能抑制TGF-β1的表达，从而抑制博来霉素诱导肺纤维化的形成。

关键词：特发性肺纤维化；骨髓间充质干细胞；博来霉素；转化生长因子β1；抑制作用；大鼠

特发性肺纤维化(IPF)是特发性间质性肺炎(IIP)中病理表现为普通型间质性肺炎(UIP)的一种类型，是一种进展的、慢性纤维性肺间质性疾病，主要发生在老年人和肺功能受限的人群中[1]。IPF的特点是进行性呼吸困难和干咳，周边或基底部网格状和蜂窝状为主的影像学表现和病理组织学结果为UIP模式。IPF目前的发病率为(6～14.6)/10万，在我国尚无确切流行病学资料，但其年发病率呈上升趋势，男性的发病率和患病率高于女性(1.5∶1～1.7∶1)，且随着年龄的增加更加显著[2]。虽然目前IPF的病因仍然不明确，它的发病机制有可能与病毒、真菌、环境因素和有毒因子等有关系，病死率高，5年的生存率与恶性肿瘤相似。因此，IPF严重威胁着病人的健康与生命，给病人家庭和社会带来了沉重的经济负担。在IPF治疗方法上，尚缺乏有效的治疗方法，因此，切实有效的治疗IPF的方法已成为目前研究重点和难点。本实验通过博来霉素(BLMS)制造大鼠肺纤维化模型，用体外培养和分离的骨髓间充质干细胞(MSC)在不同时间点移植入模型组中，观察对肺纤维化的抑制作用。

1材料与方法

1.1材料①动物购买，雄性Wistar大鼠60只，体重250 g左右，购于哈尔滨医科大学附属二院动物实验中心。②主要实验药物和试剂，博来霉素(Bleomycin，BLM)系日本化药株式会社产品；胎牛血清(美国Gibco公司)；胰酶(德国Sigma公司)；DMEM/F12(美国Gibco公司)；转化生长因子-β1(TGF-β1)免疫组化试剂盒(武汉博士德生物有限公司)；羟脯氨酸试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。③主要实验仪器，电子天平BL610、石蜡切片机、倒置相差显微镜、数显电热恒温水温箱HH.W21.600S、KR-180FA高速离心机、Olympus数码相机、流式细胞仪、恒温培养箱、紫外分光光度仪、动物手术器械、纱布、注射器等。

1.2方法①骨髓间充质干细胞的分离培养，将4周龄Wistar雄性鼠一只放至动物实验室操作台上，用0.5 mL水合氯醛腹腔注射，用无菌手术刀将鼠股骨和胫骨的皮毛剥离，在股骨头处剪断，放入培养皿中；迅速回到细胞间，取出股骨后向胫骨头剔除肌肉到关节处反向瓣，取出胫骨，放入另一培养皿中；左手用小镊子夹住骨干，右手用小剪刀将干骺端剪断，尽量多的保留干骺端；用5 mL 注射器冲洗骨髓直至骨髓变白；以1 000 r/min离心5 min；用吸管吸约5 mL含10%FBS的DMEM/F12到离心管中；血细胞计数器计算细胞总数；按1×106个细胞/cm2接种到T25的塑料培养瓶；将培养瓶放入37.0 ℃、5%CO2、饱和湿度的恒温培养箱中培养；72 h后去除未贴壁的造血细胞、全量换液，以后每隔(2～3) d换液1次。10 d～14 d，待贴壁细胞85%融合后需进行消化传代，倒置相差显微镜下观察细胞形态变化；待大部分细胞变圆悬浮后，加入10 mL含10%FBS的DMEM/F12培养液终止消化；用含10%FBS的DMEM/Fl2培养液重新悬浮细胞；按1∶2传代培养。以后各传代过程如上，根据细胞密度调整细胞传代时间及比例。

1.3动物分组大鼠称重后腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL /100 g)麻醉，锐性分离浅筋膜，用 1 mL注射器在两个环状软骨之间刺入。气管内注入含博来霉素的生理盐水(0.2～ 0.3) mL(5 mg /kg)，对照组气管内注入等体积生理盐水，以大鼠长轴为中心，立即旋转大鼠，使药液在肺内分布均匀，缝合颈部皮肤，局部青霉素消毒防止感染。将(220～250) g雌性Wistar大鼠60只随机分入以下各组，各组15只。生理盐水对照组(A组)即刻气管内注入PBS溶液50 μL；BLMS模型组(B组)，即刻气管内注入博莱霉素5 mg/kg；MSC治疗组(C组)，即刻气管内注入博莱霉素后立即尾静脉注射移植MSC 1×107/mL，200 μL；MSC治疗组(D组)，气管内注入BLMS14 d后移植MSC 1×107/mL，200 μL。

1.4标本采集与处理4组分别于造模后7 d、14 d、28 d各随机处死5只。称取小鼠体重，剖开腹腔，充分暴露腹主动脉，经腹主动脉放血后处死；剪开胸腔，分离肺组织，从右主支气管气管插管，然后结扎近端，注入4%多聚甲醛，完全冷却后加入固定液使肺复张，置于同样固定液中浸泡右肺，石蜡包埋和连续性切片，切片厚度为4 μm，其中一部分进行HE染色和Masson染色做组织诊断学用，另外一部分进行免疫组化染色。

1.5动物一般情况观察Wistar大鼠精神状态、反应灵敏度、活动情况、被毛(被毛是否光滑、有无光泽、有无脱毛)、皮肤(颜色、温度、弹性等)、食欲、体重、死亡情况。

1.6病理组织学改变HE染色参照Szapiel等方法，观察肺泡炎的程度。0级：无肺泡炎；Ⅰ级：轻度肺泡炎，镜下可见到肺泡间隔是由于单核细胞浸润而增厚，但病变仅仅局限于局部和胸膜底部，所占面积少于全肺20%，肺泡结构正常；Ⅱ级：中度肺泡炎，肺泡炎症病变较广泛，受累面积占全肺的20%～50%，胸膜基底部较重；Ⅲ级：弥漫性肺泡炎，病变范围>50%，偶可见到肺泡腔内有单核细胞及出血造成的实变。

1.7胶原纤维染色的定性分析参照Fulmer方法，用Masson染色将肺纤维化分5级：0级：正常肺组织；Ⅰ级：微小纤维化，肺泡间隔基本正常，局部有间质纤维化，无肺泡的破坏及肺网架结构的改变，肺胶原纤维与正常肺相比升高不小于10%；Ⅱ级：轻度纤维化，肺泡间隔为轻度增厚，部分区域有正常肺泡，全肺的胶原纤维与正常肺相比占10%～25%；Ⅲ级：中度纤维化，肺泡间隔中度增厚，正常肺泡少见，间质结构破坏，全肺胶原纤维与正常肺相比升高至25%～40%；Ⅳ级：严重纤维化，所有的肺泡间隔均有不同程度增厚，但仍有可辨认的肺泡结构存在，许多修复部位失去正常间质结构，全肺胶原纤维与正常肺相比升高至40%以上。

1.8大鼠肺组织细胞来源检测取(50～100) mg肺组织按照组织基因组DNA提取试剂盒方法，分别于C组7 d、14 d、28 d及D组28 d肺组织提取DNA，聚合酶链反应(PCR)扩增SRY基因。以2%琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像系统摄像，以雌、雄Wistar大鼠为阴、阳性对照。合成SRY大鼠基因，上游引物：5’- tttagtgttcagccctacagcc-3’，下 游 引 物：5’-atgctgggattctgttgagcc-3’，扩 增 长 度为322bp； 内参照：β 肌动蛋白(β-actin ) 上游引物：5’-cacgatggaggggccggactcatc-3’，下游引物：5’-taaagacctctatgccaacacagt-3’，扩增长度为240 bp。聚合酶链反应(PCR)扩增反应条件：94 ℃预变性5 min，94℃变性30 s，52 ℃退 火30 s ，72 ℃退火3 0s，循环50次，72℃延伸7 min。

1.9HYP检测取各组大鼠右肺中上叶称重(50 mg)，采用分光光度计560 nm波长比色，记录吸光度值，根据试剂盒所给公式计算待测标本的HYP含量，确定肺组织纤维化程度。

1.10免疫组织化学法测定TGF-β1蛋白表达免疫组化检测指标的半定量分析，自动计算其积分光密度(integrated optical density，IOD)值进行半定量分析。

1.11统计学处理采用SPSS13．0统计软件处理，P<0.05为有统计学意义，统计方法使用方差分析等。

2结果

2.1细胞培养第1天即贴壁，第2天时贴壁细胞较多，第3天可以看到骨髓细胞在培养瓶中长出明显的MSC克隆，为椭圆形、梭状，似成纤维细胞样。骨髓内的造血干细胞等其他的细胞在培养瓶中为悬浮方式生长，经多次换液后造血干细胞及其他的细胞逐渐减少。约10 d后原代细胞85%融合，进行传代。传代后细胞度过抑制期后迅速增长，每传1代需要(3～4)d，随着传代次数的增加，细胞形态呈均匀一致的长梭形，排列成旋涡状或放射状 。

2.2大鼠术后观察A组大鼠术后苏醒很快，苏醒后仅有短暂活力下降，恢复术前的活力快，进食好，体重逐渐增长；B组大鼠术后苏醒较慢，不爱活动，进食较少，皮毛凌乱、无光泽，唇及爪发绀，可以听到大鼠的喘息声，体重明显减轻；C组大鼠术后苏醒较慢，术后4 d～5 d内活力较差，进食较少，体重不增长，第5天后大鼠一般情况逐渐好转，体重逐渐增长。D组大鼠术后苏醒更慢，于术后7 d、8 d活力仍差，进食少，体重不增长，第8天后小鼠一般情况才逐渐好转，体重逐渐增长。

2.3肺组织HE染色、Masson染色A组光镜下可见肺泡间隔无增厚，无水肿、炎症及纤维化表现，肺泡腔没有缩小，且无明显渗出。B组灌注博来霉素后的7 d内表现为急性炎症，肺泡的间隔增厚，肺泡腔及间隔内炎症细胞聚集；第14天炎性细胞渗出明显减轻，肺泡间隔增厚，而成纤维细胞增多，肺组织以纤维化改变为主。第28天肺泡结构破坏，肺泡腔明显缩小，肺间质被胶原纤维和成纤维细胞替代，纤维化明显。C组：于7 d肺组织的充血明显减轻，点状出血明显减少，14 d和28 d双肺颜色发暗，表面较粗糙，体积缩小不明显。各时间点肺泡炎与肺纤维化评分与B组比较均显著减轻(P<0．05)，仍较A组严重(P<0．05)。D组：28 d时双肺颜色暗，表面粗糙，体积缩小不明显。肺泡炎较B组减轻，肺纤维化评分较B组减少，但均较A组、C组严重。各组肺泡炎及肺纤维化评分结果见表1、表2。

表1　各组肺泡炎程度比较(±s)　分

表2　各组纤维化程度比较(±s)　分

2.4Y染色体性别决定区SRY基因检测A组及B组检测不到SRY基因，但C组和D组各时间点均能检测到SRY基因。

2.5HYP检测肺组织纤维化程度B组注BLM后7 d，HYP含量开始升高，28 d达到最高峰，高于其他3组，与A组相比各时间点HYP含量有统计学意义(P<0.01)。C组与D组大鼠HYP含量均呈低水平升高趋势，造模后7 d、14 d、28 dHYP含量均显著低于B组(P<0.05)。与形态学肺纤维化观察结果相一致(见表3)。

表3　大鼠肺组织HYP含量比较(±s)　μg/g

2.6大鼠肺组织中TGF-β1大鼠肺组织TGF-β1蛋白表达在胞浆呈黄色或棕黄色颗粒，主要定位于肺泡巨噬细胞胞浆中，以细胞胞浆、胞膜、细胞外基质染为棕色为阳性；每张切片选取5个视野，计阳性细胞数/高倍视野(见表4)。博莱霉素处理大鼠的肺组织TGF-β1表达明显、范围广，特别是在第14天时肺泡腔和间质中出现大量的TGF-β1强阳性的肺泡巨噬细胞，肺组织中TGF-β1阳性的肺泡巨噬细胞，可以单个或成群肺泡巨噬细胞出现。

表4　各组TGF-β1表达阳性巨噬细胞数

3讨论

在间质性肺疾病中，以IPF最为常见，预后极差，从最初确诊到死亡的平均时间是(3～5)年。尽管过去数十年在IPF发病机制研究取得了很大进展，但其发病机制尚不十分清楚。过去认为IPF是一种慢性的炎症反应，因而解释了最初使用皮质类固醇激素治疗的原因。目前糖皮质激素为治疗IPF的经典药物，但是仅有10%～30%的IPF病人对糖皮质激素治疗有一定的疗效[3]，而且没有完全或持续缓解者，因此有学者不推荐单独使用糖皮质激素治疗IPF病人。且糖皮质激素副反应大，临床应用受限。近年来，随着对本病发病机制和病理生理变化的研究以及分子生物学技术的应用，干细胞的研究引起了人们的极大关注，其中研究最多的是MSC。在体外特定的条件下，MSC 可以定向诱导分化为骨、软骨、脂肪、心肌、神经、皮肤上皮、肝脏、胰岛B 细胞等多种类型细胞[4]，被认为是组织工程领域的理想种子细胞来源。本实验研究的是MCS对博来霉素诱导的肺纤维化的治疗机制。文献上报道的构建肺纤维化模型的方法有多种，如应用博来霉素、百草枯、放射线、高浓度氧等，博莱霉素气管内给药因存在方法可靠、操作简单、制模时间短等[5]优点，且博莱霉素致纤维化动物模型与人类IPF的病理学改变相似，所以用博莱霉素复制肺纤维化动物模型是目前普遍采用的方法[6]。本实验表明：灌注博来霉素后7 d内表现为急性炎症，肺泡间隔明显增厚，肺泡腔及间隔内炎症细胞聚集；于第14天时炎性细胞渗出减轻，成纤维细胞增多，肺组织以纤维化改变为主。于第28天肺泡结构破坏，肺泡腔明显缩小，纤维化明显。说明大鼠肺纤维化模型造模成功。

骨髓来源干细胞疗法是生物学发展最为迅速的领域之一。骨髓间充质干细胞是由中胚层发育的早期细胞，有着较强的自我增殖能力和多向分化潜能，因此为许多复杂疾病的治疗带来了曙光。按发生学来源可将干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。近年来，越来越多的证据表明成体干细胞具有较强的多系分化潜能，大量的研究显示成体干细胞可以向包括肺组织在内的多种非造血细胞类型分化[7]。作为成体干细胞的一种，MSC在研究和应用方面具有以下优点：①可自体移植避免了免疫排斥；②在正常情况下处于静止状态，只有在病理情况下才显示出一定的自我更新潜能，因此癌变的可能性较小；③由于分化潜能比较局限，更容易被诱导向特定的组织细胞分裂，可以直接用于体内组织的原位修复；④某种类型的成体干细胞有向同种组织的损伤部位迁移的趋势，这有助于临床应用干细胞来进行疾病替代治疗时的定位；⑤分离和使用成体干细胞不存在伦理学问题[8]。至今为止，MSC的分离、培养方法比较常用的是贴壁细胞分离法、密度梯度离心法、流式细胞分选法、免疫磁珠分离法等。本实验所采取的是全骨髓贴壁细胞分离法，这个方法操作比较简单、快速、容易掌握、不易污染，比较符合细胞生长的微环境，可经过多次传代以获得足够量细胞的优点。收集第4代MSC细胞用于实验，经过3次传代后可以获得足够的细胞数量；另外第4代细胞很好地保持了其分化特性，符合实验要求。

转化生长因子-β1最初是从血小板中分离出来的一种细胞因子，因其能促进成纤维细胞转化生长而得名。它是由多种细胞分泌的具有多重生物学效应的细胞因子。TGF-β1是迄今发现的最强的细胞外基质沉积促进剂，其作用于多个环节，刺激各种细胞外基质成分合成和沉积，在减少基质降解酶及增加降解抑制剂合成的同时，还是一个强大的细胞增殖调节剂，促进肺成纤维细胞增殖，在肺纤维化发展中起关键作用，是目前研究最多的纤维化促发因子[9]。早期通过趋化炎症细胞参与肺损伤和炎症反应，而后主要是促进细胞外基质形成和抑制其酶解作用，促进纤维蛋白原向肌成纤维细胞转化，同时影响其他纤维化细胞因子，导致纤维化发生[10]。本实验研究结果表明，博来霉素灌注后第7天可见肺泡腔和间质中出现较多的TGF-β1强阳性的肺泡巨噬细胞，第14天时肺泡腔和间质TGF-β1阳性的肺泡巨噬细胞达到高峰，于第28天肺组织中TGF-β1阳性的肺泡巨噬细胞比第7天及第14天减少。与B组比较，C组、D两组肺组织中TGF-β1阳性的巨噬细胞数量明显少，差异有统计学意义。

外源性MSC的确能移植到损伤肺组织中，并具有减轻肺泡炎、肺纤维化的作用。MSC在体外培养即能分泌TGF-β1，且该细胞因子有抑制淋巴细胞增殖的作用，而当MSC进入实验动物体内后，由于微环境的改变，TGF-β1的表达可能会有改变，因此其在这个修复过程中的作用需进一步研究。

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(本文编辑王雅洁)

中图分类号：R551.3R285.5

文献标识码：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.10.011

文章编号：1672-1349(2016)10-1091-04

(收稿日期：2016-03-03)